Ensaig enzimàtic
Els ensajos enzimàtics són métodos d'ensaig químic per a medir activitats enzimàtiques. Són vitals per a l'estudi de les cinètiques enzimàtiques i l'inhibició enzimàtica.
Unitats enzimàtiques
[editar | editar còdic]Les cantitats d'enzima poden ser expressades en molés, com les de qualsevol un atre compost químic, o poden ser quantificades en térmens d'activitat enzimàtica. L'activitat enzimàtica és una mida de la cantitat d'enzima activa present i del nivell d'activitat de la mateixa, per lo que la mida de l'activitat és depenent de les condicions, que deuen ser especificades quan es donen valors d'activitat. L'activitat expressa la cantitat de substrat convertit per unitat de temps, tenint en conte el volum de reacció.
En el Sistema Internacional d'Unitats l'unitat per a l'activitat catalítica és el katal (kat), pero és una unitat massa gran i sol usar-se l'unitat d'activitat enzimàtica (UI).
- 1 kat = 1 mol substrat convertit x s-1 = 6 x 107 UI
- 1 UI = 1 μmol substrat convertit x min-1 = 16,67 nkat
Una atra unitat comunament usada és l'activitat específica. Esta es referix a l'activitat d'una enzima per miligram (mg) de proteïna, i se sol expressar en: μmol x min-1 x mg-1). L'activitat específica dona una idea de la purea de l'enzima.
Tipos d'ensaig
[editar | editar còdic]Segons la fase de la reacció estudiada
[editar | editar còdic]Tots els ensajos enzimàtics medixen el substrat consumit o el producte generat en la reacció durant un temps. Existix un gran número de métodos diferents per a medir la concentració de substrats i productes, i moltes enzimes poden ser ensajades de diferents maneres. Habitualment en bioquímica s'estudien les reaccions catalizadas per enzima usant quatre tipos d'experiments:[1]
- Medida de la velocitat inicial. Quan una enzima es mescla en un gran excés de substrat (a concentració saturante), el complex intermig enzima-substrat es genera en una ràpida fase inicial transitòria. Despuix, la reacció aplega a una cinètica constant durant la qual el complex enzima-substrat es manté pràcticament en cantitats invariables en el temps i la velocitat de reacció és constant. La velocitat es medix en un curt periodo despuix de conseguir un estat cuasi-constant, que es detecta típicament monitorizando l'acumulació de producte durant el temps. Com les medicions s'efectuen en un periodo molt curt i per la concentració saturante de substrat, pot considerar-se que el substrat lliure és igual al substrat inicial i que la velocitat medida és la màxima que l'enzima pot alcançar en les condicions de reacció donades, perque no s'estan donant reaccions inverses o degradació enzimàtica. Estes medicions són les més simples de realisar i analisar en estar relativament lliures de complicacions i, per tant, est el tipo d'ensaig més usat en cinètica enzimàtica.
- Medida del progrés de la curva. En estos experiments els paràmetros cinètics es determinen a partir d'expressions de les concentracions de les diferents espècies com funcions del temps. La concentració del substrat o del producte es medix en moments posteriors a la ràpida fase inicial i durant un temps lo suficientment llarc que permeta a la reacció acostar-se al equilibri. Este tipo d'ensajos s'intenta evitar per l'error matemàtic que es pot introduir i és cada volta menys practicat, pero va ser molt àmpliament utilisat en els primers periodos de l'estudi de la cinètica enzimàtica.
- Medida de la fase transitòria. En estos experiments s'observa el comportament de la reacció durant la ràpida fase inicial transitòria en la que el complex molecular intermig aplega a un periodo cinètic constant. Estos són els ensajos més difícils de realisar perque requerixen l'us de tècniques de mesclat i medició realment ràpides.
- Experiments en la fase d'equilibri. En estos experiments es pertorba una mescla d'enzima, substrat i producte que ha alcançat l'equilibri químic, per eixemple canviant la temperatura, la pressió o el pH, i s'estudia cóm retorna la mescla a l'equilibri. L'anàlisis d'estos experiments requerix que la reacció siga reversible. Ademés, estos experiments són relativament insensibles a detalls mecanísticos i, per lo tant, no solen usar-se per a l'identificació de mecanismes de reacció.
Segons el seguiment de la reacció
[editar | editar còdic]Els ensajos enzimàtics poden dividir-se en dos grups segons la manera en que se seguix la medició. Per una part estan els ensajos continus, en els que el método oferix una llectura contínua de l'activitat monitorizando a temps real el substrat consumit o el producte generat. Per una atra part existixen ensajos discontinus, en els que la reacció es deté en un punt i es medix la concentració dels substrats o els productes.
Ensajos continus
[editar | editar còdic]Són els més convenients, en obtindre simplement en l'ensaig la velocitat de la reacció, sense necessitar treball adicional. Hi ha molts tipos diferents.
Espectrofotométricos
[editar | editar còdic]En els ensajos espectrofotométricos pot seguir-se el curs d'una reacció observant cóm canvia la llum absorbida per la solució en la que s'està donant la reacció. Per a poder utilisar un ensaig d'este tipo deu haver entre els substrats o els productes algun que absorbixca llum a una llongitut d'ona determinada, i que siga l'única molècula de la mescla de reacció que ho fa a la mateixa; d'esta forma, es pot observar l'aument o la disminució de l'absorbancia a dita llongitut d'ona.
Quan la llum absorbida es troba en l'espectre visible és possible observar un canvi en el color de la mostra, i llavors parlem de método colorimètric.
També és usual l'us de la llum ultravioleta (llum UV), especialment perque servix per a monitorizar reaccions en les que participen NADH i NADPH, coenzimas que participen en infinitat de reaccions bioquímiques i que absorbixen llum UV en forma reduïda (NADH i NADPH) pero no en forma oxidada (NAD+ i NADP+). Aixina, l'activitat d'una oxidorreductasa que use NADH com coenzima pot ser monitorizada seguint el descens de la absorbancia a 340 nm a mida que es consumix el NADH.[2]
Ensajos directes i acoplats
Inclús quan la reacció enzimàtica a estudiar no provoca cap canvi d'absorbancia o esta no és específica, poden usar-se ensaig espectrofotométricos per a l'enzima realisant un ensaig acoplat. En est, el producte de la reacció a estudiar s'usa com a substrat d'una segona reacció, que ha de ser de fàcil seguiment i que els seus atres substrats, coenzimas i enzimes deuen trobar-se a concentracions saturantes per a que la velocitat de la segona reacció siga la màxima. Per eixemple, en la figura 1 pot vore's l'esquema d'un ensaig acoplat per a la hexoquinasa, que pot medir-se acoplant la producció de glucosa-6-fosfat a la producció de NADPH usant la Glucosa-6-fosfat deshidrogenasa
Fluorimétricos
[editar | editar còdic]En el fenomen de la fluorescència una molècula emet llum d'una llongitut d'ona determinada despuix d'absorbir llum a una atra llongitut d'ona. Els ensajos fluorimétricos usen la diferència en la fluorescència entre producte i substrat per a medir la reacció enzimàtica. Estos ensajos són generalment molt més sensibles que els espectrométricos, ya que són més específics en tindre que utilisar dos llongituts d'ona en lloc d'una, pero poden sofrir més interferències per impurees presents en el mig o per l'inestabilitat que molts composts fluorescents presenten en ser exposts a la llum.
Un eixemple d'estos ensajos és, una volta més, l'us de les coenzimas NADH i NADPH. En este cas, les formes reduïdes són fluorescents i les oxidadas no. Les reaccions d'oxidació poden, per tant, ser seguides pel descens de l'intensitat de fluorescència, i les de reducció per l'aument.[3] També existixen substrats sintètics que lliberen un fluoróforo en reaccions catalizadas per enzima, com per eixemple el 4-metilumbeliferil-β-D-glucurónido per a ensajar la β-galactosidasa.
Calorimétricos
[editar | editar còdic]La calorimetria és la mida de la calor lliberada o absorbit per una reacció química. Estos ensajos són molt generals, ya que moltíssimes reaccions duen associat algun canvi de calor i utilisant un microcalorímetro no és necessari utilisar grans cantitats d'enzima o substrat. Estos ensajos poden ser usats per a medir reaccions impossibles de medir en atres métodos.[4]
Quimioluminiscencia
[editar | editar còdic]La quimioluminiscencia és l'emissió de llum per una reacció química. Algunes reaccions enzimàtiques produïxen llum i esta pot ser medida per a detectar la formació de producte. Estos tipos d'ensaig poden ser extremadament sensibles, ya que la llum produïda pot ser registrada en una película fotogràfica per dies i inclús semanes, pero al mateix temps són de difícil quantificació, perque no tota la llum emesa per la reacció serà detectada.
La detecció de la peroxidasa de rave per quimioluminiscencia enzimàtica (ECL, enzymatic chemiluminiscence) és un método comú per a detectar anticossos en el western blot. Un atre eixemple d'quimioluminiscencia és la luciferasa, enzima present en les luciérnagas que produïx llum de forma natural a partir del seu substrat, luciferina.
Ensajos discontinus
[editar | editar còdic]En un ensaig discontinu es prenen mostres d'una reacció enzimàtica en intervals i es medix en elles la cantitat de producte format o substrat consumit.
Radiométricos
[editar | editar còdic]En els ensajos radiométricos es medix l'incorporació de radiactivitat en els substrats o la seua lliberació des de substrats. Els radioisòtops més usats en estos ensajos són 14C, 32P, 35S i 125I. Com els isòtops radiactius permeten el marcage d'un sol àtom d'un substrat, estos ensajos són extremadament sensibles i específics. Són freqüentment utilisats en bioquímica i són a sovint l'única manera de medir una reacció específica en extractes crus (mescles complexes de les enzimes lliberades al lisar cèlules).
En estos procediments la radiactivitat és normalment medida en contadors de centelleo.
Cromatogràfics
[editar | editar còdic]En els ensajos cromatogràfics es medix la formació de producte separant els components de la mescla de reacció per cromatografía. Normalment, es porta a terme per mig de HPLC. Encara que esta aproximació pot requerir grans cantitats de material de partida, la seua sensibilitat pot incrementar-se per mig de marcage radiactiu dels substrats o els productes.
Factors que afecten a l'ensaig
[editar | editar còdic]- Força osmótica: La majoria de les enzimes no poden tolerar concentracions de sal extremadament altes. Els ions interferixen en els dèbils enllaços iònics de les proteïnes. Les enzimes típiques són actives en concentracions salines d'1 a 500 mm. Existixen excepcions com les enzimes de les algas i bactèrias halófilas.
- Temperatura: Totes les enzimes treballen en un ranc de temperaturas específiques de l'organisme al que pertanyen. Els auments de temperatura generalment provoquen un increment de la velocitat de reacció. Açò es deu a alteracions de l'estructura de la proteïna degudes a l'interrupció d'unions iòniques que resulten en l'estabilisació de l'estructura tridimensional de l'enzima. La temperatura òptima de les enzimes humanes es troba generalment entre els 35 i els 40 °C; la temperatura mija de l'organisme del ser humà és 37 °C. Aixina, les enzimes humanes comencen a desnaturalizarse ràpidament a partir dels 40 °C. En canvi, les enzimes de les estoves termófilas, que es troben en manantialés calentes, són estables fins a a 100 °C.[5] No obstant, l'idea d'una velocitat "òptima" per a una reacció enzimàtica és enganyosa, ya que la velocitat observada a qualsevol temperatura és el producte de dos velocitats, la velocitat de reacció i la velocitat de desnaturalización. Si s'usara un ensaig per a medir esta segona activitat per segon, la velocitat seria alta a altes temperatures, i usant un ensaig per a quantificar la formació de producte esta seria baixa a eixes temperatures.
- pH. La majoria de les enzimes són sensibles al pH i té un ranc específic en el que es detecta activitat; totes tenen un pH òptim. El pH pot detindre l'activitat enzimàtica en provocar la desnaturalización de l'estructura proteica trencant enllaços iònics i ponts d'hidrogen. La majoria de les enzimes funcionen entre un pH 6 i 8; no obstant, la pepsina estomacal té un pH òptim de 2 i la tripsina de 8.
- Saturació del substrat. Aumentant la concentració de substrat aumenta la velocitat de la reacció o activitat enzimàtica. No obstant, el llímit de saturació llimita la velocitat. Una enzima està saturada quan els llocs actius de totes les molècules estan ocupats la majoria del temps. A partir del punt de saturació la reacció no pot accelerar-se per mig d'adició de substrat, siga com siga la cantitat afegida. En un gràfic la velocitat de reacció hauria alcançat un replanell.
Referències
[editar | editar còdic]- ↑ Schnell, S., Chappell, M. J., Evans, N. D. and Roussel, M. R. The mechanism distinguishability problem in biochemical kinetics: The single-enzyme, single-substrate reaction as a case study. Comptes Rendus Biologies 2006; 329, 51-61. DOI: 10.1016/j.crvi.2005.09.005
- ↑ Bergmeyer, H. U. "Methods of Enzymatic Analysis", Vol. 4, Academic Press (New York, NY:1974), pp.2066-2072.
- ↑ Passonneau, J. V., and Lowry, O. H. "Enzymatic Analysis. A Practical Guide", Humana Press (Totowa, NJ:1993), pp.85-110.
- ↑ Todd MJ, Gomez J. Enzyme kinetics determined using calorimetry: a general assay for enzyme activity? Anal Biochem. 2001 Sep 15; 296(2):179-87
- ↑ Cowan DA(1997).118(3)
- 429-38.
- Este artícul conté una traducció derivada de «Ensayo enzimático» de Wikipedia en castellà publicada baix la Llicència de documentació lliure de GNU i la Llicència Creative Commons Reconeiximent-CompartirIgual 4.0 Internacional.