Cinètica enzimàtica
La cinètica enzimàtica estudia la velocitat de les reaccions químiques que són catalizadas per les enzimas. L'estudi de la cinètica i de la dinàmica química d'una enzima permet explicar els detalls del seu mecanisme catalític, el seu paper en el metabolisme, cóm és controlada la seua activitat en la cèlula i cóm pot ser inhibida la seua activitat per fàrmacs o verís o potenciada per un atre tipo de molèculas.
Les enzimes, en la seua majoria, són proteïnas en la capacitat de manipular atres molècules sense ser alterats per la reacció,[1] eixes molècules són denominades substrats. Un substrat és capaç d'unir-se al lloc actiu de l'enzima que ho reconega i transformar-se en un producte a lo llarc d'una série de passos denominats mecanisme enzimàtic. Algunes enzimes poden unir varis substrats diferents i/o lliberar diversos productes, com és el cas de les proteasas en trencar una proteïna en dos polipèptits. En atres casos, es produïx l'unió simultànea de dos substrats, com en el cas de l'ADN polimerasa, que és capaç d'incorporar un nucleòtit (substrat 1) a un bri d'ADN (substrat 2). Encara que tots estos mecanismes solen seguir una complexa série de passos, també solen presentar una etapa limitante que determina la velocitat final de tota la reacció. Esta etapa limitante pot consistir en una reacció química o en un canvi conformacional de l'enzima o del substrat.
El coneiximent adquirit sobre l'estructura de les enzimes ha segut de gran ajuda en la visualisació i interpretació de les senyes cinètiques. Per eixemple, l'estructura pot sugerir cóm permaneixen units substrat i producte durant la catálisis, quins canvis conformacionales ocorren durant la reacció, o inclús el paper en particular de determinats residus aminoàcits en el mecanisme catalític. Algunes enzimes modifiquen la seua conformació significativament durant la reacció, en el cas de la qual, pot ser crucial saber l'estructura molecular de l'enzima en i sense substrat unit (se solen usar anàlecs que s'unixen pero no permeten portar a terme la reacció i mantenen a l'enzima permanentment en la conformació de substrat unit).
Els mecanismes enzimàtics poden ser dividits en mecanisme d'únic substrat o mecanisme de múltiples substrats. Els estudis cinètics portats a terme en enzimes que solament unixen un substrat, com la triosafosfato isomerasa, pretenen medir l'afinitat en la que s'unix el substrat i la velocitat en la que ho transforma en producte. Per un atre costat, en estudiar una enzima que unix varis substrats, com la dihidrofolato reductasa, la cinètica enzimàtica pot mostrar també l'orde en el que s'unixen els substrats i l'orde en el que els productes són lliberats.
No obstant, no totes les catálisis biològiques són portades a terme per enzimes proteiques. Existixen molècules catalítiques basades en l'ARN, com les ribozimas i els ribosomas, essencials per al splicing alternatiu i la traducció del ARNm, respectivament. La principal diferència entre les ribozimas i les enzimes radica en el llimitat número de reaccions que poden portar a terme les primeres, encara que les seues mecanismes de reacció i les seues cinètiques poden ser estudiades i classificades pels mateixos métodos.
Principis generals
[editar | editar còdic]
La reacció química catalizada per una enzima utilisa la mateixa cantitat de substrat i genera la mateixa cantitat de producte que una reacció no catalizada. De la mateixa manera que ocorre en atres tipos de catálisis, les enzimes no alteren en absolut l'equilibri de la reacció entre substrat i producte.[2] Solament aumentaran l'eficiència de la reacció, fins al moment en que tots els llocs possibles estiguen ocupats. En eixe moment s'haurà alcançat el punt de saturació de l'enzima i, encara que s'afigga més substrat, no aumentarà més l'eficiència de la mateixa.
Ensajos enzimàtics
[editar | editar còdic]- Artícul principal → Ensaig enzimàtic.
Un ensaig enzimàtic és un procediment, portat a terme en un laboratori, per mig del qual es pot medir la velocitat d'una reacció enzimàtica. Com les enzimes no es consumixen en la reacció que catalizan, els ensajos enzimàtics solen medir els canvis experimentats be en la concentració de substrat (que va decreixent), be en la concentració de producte (que va aumentant). Existixen diversos métodos per a realisar estes mides. l'espectrofotometría permet detectar canvis en l'absorbancia de llum per part del substrat o del producte (segons la concentració d'estos) i la radiometria implica incorporació o lliberació de radiactivitat per a medir la cantitat de producte obtingut per temps. Els ensajos espectrofotométricos són els més utilisats, ya que permeten medir la velocitat de la reacció de forma contínua. Pel contrari, els ensajos radiométricos requerixen retirar les mostres per a medir-les, per lo que són ensajos discontinus. No obstant, estos ensajos són extremadament sensibles i permeten detectar nivells molt baixos d'activitat enzimàtica.[3] També es pot utilisar l'espectrometria de masses per a detectar l'incorporació o lliberació d'isòtops estables quan el substrat és convertit en producte. Actualment existixen métodos senzills que es poden amprar en alumnes de bachillerat com el propost per Johnson R.J. i colaboradors,[4] els qui ampren hidrolasas de serina i un substrat fluorogénico. Este método és ràpit, sensible i permet medir la cinètica enzimàtica, a través de la generació de fluoresceïna com a producte.
Els ensajos enzimàtics més sensibles utilisen làserés dirigits a través d'un microscopi per a observar els canvis produïts en enzimes individuals quan catalizan una reacció. Estes mides poden utilisar canvis produïts en la fluorescència de cofactorés que intervenen en el mecanisme de catálisis o be unir molècules fluorescents en llocs específics de l'enzima, que permeten detectar moviments ocorreguts durant la catálisis.[5] Estos estudis estan donant una nova visió de la cinètica i la dinàmica de les molècules individuals, en oposició als estudis de cinètica enzimàtica tradicionals, en els que s'observa i es medix el comportament d'una població de millons de molècules d'enzima.
En la figura de la dreta es pot observar la típica evolució d'una curva obtinguda en un ensaig enzimàtic. Inicialment, l'enzima transforma el substrat en producte seguint un comportament llineal. A mida que alvança la reacció, es va agotant la cantitat de substrat i va disminuint la cantitat de producte que es genera per unitat de temps (disminuïx la velocitat de la reacció), lo que es manifesta en forma de curva asintòtica en la gràfica. Depenent de les condicions de l'ensaig i del tipo d'enzima, el periodo inicial pot durar des de milisegons fins a hores. Els ensajos enzimàtics solen estar estandardisats per a que el periodo inicial dure entorn a un minut, per a portar a terme les mides més fàcilment. No obstant, els moderns equips de mescla ràpida de líquits permeten portar a terme mides cinètiques de periodos inicials la duració dels quals pot aplegar a ser inferior a un segon.[6] Este tipo d'ensajos ràpits són essencials per a mides de la cinètica de l'estat estacionario, discutida més avall.
La majoria dels estudis de cinètica enzimàtica se centren en el periodo inicial, és dir, en la zona llineal de la reacció enzimàtica. No obstant, també és possible medir tota la curva de la reacció i ajustar estes senyes a una equació no llineal. Esta forma de medir les reaccions enzimàtiques és denominada anàlisis de la curva de progrés.[7] Este método és molt útil com a alternativa a les cinètiques ràpides, quan el periodo inicial és massa ràpit per a ser medit en precisió.
Factors fisicoquímicos que poden modificar l'activitat enzimàtica
[editar | editar còdic]- Temperatura: les enzimes són sensibles a la temperatura podent vore's modificada la seua activitat per este factor. Els rancs de temperatures òptims poden aplegar a variar substancialment d'unes enzimes a unes atres. Normalment, a mida que aumente la temperatura, una enzima vorà incrementada la seua activitat fins al moment en que comence la desnaturalización de la mateixa, que donarà lloc a una reducció progressiva de dita activitat.
- pH: el ranc de pH òptim també és molt variable entre diferents enzimes. Si el pH del mig s'allunta de l'òptim de l'enzima, esta vorà modificada la seua càrrega elèctrica en acceptar o donar protones, lo que modificarà l'estructura dels aminoàcits i per tant l'activitat enzimàtica.
- Concentració salina: de la mateixa manera que en els casos anteriorment mencionats, la concentració de sals del mig és crucial per a una òptima activitat enzimàtica. Una elevada concentració o una absència de sals en el mig poden impedir l'activitat enzimàtica, ya que les enzimes precisen d'una adequada concentració d'ionés per a mantindre la seua càrrega i la seua estructura.
Referències
[editar | editar còdic]- ↑ Rodar-te, Beatriz (2013). Manual de pràctiques de biologia molecular de la cèlula I, Facultat de Ciències, UNAM.
- ↑ Ebbing, D.D. General chemistry
- ↑ Eisenthal R. Danson M.J. (Eds), Enzyme Assays: A Practical Approach. Oxford University Press (2002) ISBN 0-19-963820-9
- ↑ Johnson, R.J., Hoops, G.C., Savas, C.J., Kartje, Z., Lavis, L.D., A Sensitive and Robust Enzyme Kinetic Experiment Using Microplates and Fluorogenic Ester Substrates. Journal of Chemical Education. 2015; 92 (2), 385-388.
- ↑ Xie XS, Lu HP. Single-molecule enzymology. [1] archivat en Wayback Machine. J Biol Chem. 1999 Jun 4;274(23):15967-70. PMID 10347141
- ↑ Gibson Q.H. Rapid mixing: Stopped flow Methods in Enzymology, (1969) 16:187-228
- ↑ Duggleby, R.G. Analysis of enzyme progress curves by senar-linear regression. Methods in Enzymology, (1995) 249:61-90.
- Este artícul conté una traducció derivada de «Cinética enzimática» de Wikipedia en castellà publicada baix la Llicència de documentació lliure de GNU i la Llicència Creative Commons Reconeiximent-CompartirIgual 4.0 Internacional.