Criopreservación

Almagasenament a baixa temperatura (en nitrogen líquit) en tubos criogènics, ilustrant la criopreservación de mostres biològiques.

La criopreservación o crioconservación és el procés en el qual les cèlulas o teixits són congelats a molt baixes temperatures, generalment entre -80 °C i -196 °C (el punt d'ebullició del nitrogen líquit) per a disminuir les funcions vitals d'una cèlula o un organisme i poder-ho mantindre en condicions de vida suspesa per molt temps. A eixes temperatures, qualsevol activitat biològica, incloses les reaccions bioquímiques que produirien la mort d'una cèlula, queden efectivament detingudes. Els métodos de criopreservación busquen alcançar baixes temperatures sense causar danys adicionals causats per la formació de gèl durant la congelació.

La criopreservación tradicional s'ha basat en recobrir el material a congelar en una classe de molècules denominades crioprotectores. S'investiguen constantment nous métodos per la toxicitat inherent de molts crioprotectores. Per defecte, deu considerar-se que la criopreservación altera o compromet l'estructura i funció de les cèlules a menos que es demostre lo contrari en una població celular particular.

Elements d'una unitat de criopreservación

Cambra de congelació

Com el seu nom ho indica és l'unitat que permet congelar o «criopreservar» la mostra biològica per llarc temps, preservant al mateix temps la seua viabilitat. Un sistema controlat per computadora controla el grau de congelació del vapor del nitrogen per a evitar la deterioració de la cèlula per fenomens osmóticos o per la cristalisació de l'aigua.

Unitat d'almagasenament

És en a on s'almagasena la mostra en acabant de que esta ha alcançat la temperatura desijada. Ya en esta unitat a la mostra se li coloquen gradillas adequades al volum i al tipo de mostra.

La criopreservación és útil per a les tècniques de reproducció assistida, a les quals acodixen parelles en problemes de fertilitat. Aixina es congela el semen del donant, en la finalitat de realisar varis intents de fecundació del òvul en el moment més adequat.

Criopreservación en reproducció assistida

Criopreservación d'espermatozoides

Esta criopreservación va a resultar molt interessant a l'hora de voler conservar mostres de pacients que per eixemple van a sometre's a un tractament de quimioteràpia, que volen retardar la paternitat o que volen sometre's a una vasectomia.

Com anem a dispondre de millons anem a necessitar estandardisar el método. D'esta forma, anem a trobar cinc métodos:

1) Método 1: Alicuotar en menuts volums (menys de 0,5 ml) en un volum igual de mig de congelació i sumergir en nitrogen líquit.

2) Método 2: Afegir el crioprotector i mantindre 45 minuts a 4 °C previ a sumergir en nitrogen.

3) Método 3: Incubar a 4 °C i formar gotes sobre un bloc de CO₂ sòlit.

4) Método 4: Incubar a 4 °C i mantindre dos hores en vapors de nitrogen. D'esta forma se simula una rampa suau de congelació.

5) Método 5: Usar un congelador biològic programable.

A pesar de l'existència de quatre métodos, solament a partir del tercer es van a obtindre taxes de supervivència acceptables, és dir, que siguen superiors al 50%.

La solució de congelació serà mig estàndart d'espermatozoide, tampó pH, antibiòtics i crioprotectores com el glicerol o la yema.

S'ha observat que només a partir del tercer método s'obtenen taxes de supervivència acceptables que estan per damunt del 50%. No obstant la supervivència també va a dependre del volum de congelació i del sistema d'envasament utilisat que pot ser per mig de pajuelas, criotubos o ampolles.

La descongelación de les mostres es realisarà a temperatura ambiente. Ademés es realisarà un llavat en mig de cultiu i una incubació a 37 °C per a una recuperació de la movilitat (açò últim de forma opcional).

Criopreservación d'embrions

En este cas la supervivència va a ser més crítica que en la criopreservación dels espermatozoides. En primer lloc és necessari aclarir uns conceptes clau:

• La seua taxa de supervivència va a ser inferior a la dels espermatozoides.
• Es considera que un embrió ha sobrevixcut a la congelació si té la mitat o més de les seues cèlules en les que es va congelar intactes i si despuix de posar-ho en cultiu s'obté un embrió en dia 3 o dia 5-6 de bona calitat.
• Solament es podrà portar a terme en un congelador programable i un bon protocol.
• Quan un embrió sobreviu intacte les seues possibilitats d'implantar van a ser les mateixes que en fresca.
• En el cas de que despuix de la congelació l'embrió tinga més de la mitat de les seues cèlules lisadas, tindrà menys possibilitats d'implantar.

La congelació dels embrions es va a portar a terme en els embrions sobrers d'un tractament de reproducció assistida. D'esta forma, les pacients podran en un futur sometre's a la transferència de més embrions o podran donarlos, tant per a atres parelles com per a l'investigació.

La criopreservación d'embrions en divisió deu realisar-se preferentment en estats exponencials de mitosis, és dir, quan els embrions presenten 2,4,8 cèlules. Açò es deu a que la resposta de la cèlula al procediment de criopreservación varia durant el cicle celular. En estats intermijos de clivaje algunes cèlules es poden trobar en distintes etapes de divisió, inclús en el huso mitòtic ensamblado. De modo que és possible provocar danys a nivell cromosòmic lloc que les baixes temperatures afecten a dit us.

La solució amprada en la congelació consta d'un crioprotector cridat PROH, el qual està preparat en buffer fosfat alcalino (PBS) suplementado en un 20% de proteïna i sacarosa.

Habitualment la taxe de supervivència per embrió està entre el 50 i el 70%. Pero cada estadi embrionari presenta les seues característiques pròpies. En els següents punts es descriuen les seues taxes de supervivència particulars i els components principals dels seus mijos de congelació:

• Zigotos: 95% --> PrOH + sacarosa
• Embrió en dia 2: 75% --> PrOH + sacarosa
• Embrió en dia 3: 60% --> PrOH + sacarosa
• Embrió en dia 5-6: < 50% --> Glicerol + sacarosa

• Aixina i tot hi ha cohortes completes d'embrions que no sobreviuen a la descongelación sense explicació apararente en un 10% de les descongelación.

Criopreservación d'ovòcits

Dels elements implicats en la reproducció assistida, l'ovòcit, és el material més sensible al procés de criopreservación. Este fet es deu provablement a que la seua placa metafásica és molt sensible.
Els ovòcits sobreviuen poc i mal a la congelació, sent la taxa de gestació per cicle d'descongelación solament del 10%. L'ovòcits sobreviuen poc i mal a la congelació, sent la taxa de gestació per cicle d'descongelación solament del 10% un 5% aproximadament.^{cita requerida}
De manera que fan falta uns 60 ovòcits per a conseguir una gestació. Estos números posen de relleu la gran sensibilitat dels ovòcits a la criopreservación.^{cita requerida}

La congelació llenta sembla haver aplegat a un eficiència màxima que no és del 100% i que és difícil d'aplicar a blastocistos i sobretot als ovòcits.

S'ha observat que esta tècnica pot presentar algunes conseqüències negatives com a alteracions en la metilación de el ADN i la modificació de les histona. La triple metilación de les lisinas 4 (K4) i 27 (K27) de la histona H3 (H3K4em3 i H3K27em3) està associada a l'activació i repressió de gens, respectivament. S'han observat nivells de metilación per a H3K4em3 un 20% més baixos per als ovòcits congelats, mentres que els nivells per a H3K27em3 eren més alts en els blastocitos vacuns congelats i descongelados. La raó acceptada per a este fenomen és l'estrés celular, especialment per l'estrés oxidativo.

les referencies sense nom deuen de tindre contingut
En un atre estudi, es varen demostrar la pèrdua de metilación de H19/ IGF2 en embrions de rata cultivats in vitro en comparació als in viu, en un efecte major en el grup <o>vitrificado</o>. Els ovòcits de rata en metafase II que varen ser vitrificados i posteriorment descongelados tenien nivells de metilación de H19, Peg 3 i SNPRN disminuïts en comparació als controls no vitrificados.

Vitrificació d'embrions

Artícul principal → VitrificacióVitrificació i embriologia .

La vitrificació és l'actual tècnica en la que es preserva la fertilitat. A diferència de la congelació tradicional, esta tècnica permet preservar els òvuls sense mermar la seua calitat. Açò ocorre principalment per la velocitat de refredat, de 23000 °C/min, lo que provoca que l'aigua en l'interior de la cèlula no tinga temps de cristalizarse. El método més habitual és el Cryotop. Es tracta d'un soport que consistix en un mànec de plàstic al que va unida una tira transparent. Pot sostindre 4 ovòcits, o 3 embrions en dia 3, o 1 blastocisto.

La vitrificació generalment requerix l'adició de crioprotectores, molècules que permeten un major grau de supervivència celular durant la congelació, en reduir el punt de congelació i protegir la membrana celular de les lesions causades per la congelació.

En lloc de cristalizar, la solució almibarada es convertix en un gèl amorfo: es vitrifica. En lloc d'un canvi de fase de líquit a sòlit per cristalisació, es genera l'estat amorfo, que és com un «líquit sòlit». La transformació està en un menut ranc de temperatura descrit com la temperatura de «transició vítrea».

Sistemes de vitrificació.

Existixen dos tipos de sistemes de vitrificació:

• Sistema de vitrificació obert: expon la mostra directament al mig ambient.
• Sistema de vitrificació tancat: els dispositius tancats protegixen la mostra de la possible transmissió de malalties des del mig ambient. Especialment, s'utilisa per a almagasenar mostres de risc biològic, contaminades per VIH o hepatitis.