CHIP-on-chip
CHIP-on-chip (també conegut com a CHIP-chip) és una tecnologia que combina inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) en micromatriz de ADN (chip). De la mateixa manera que CHIP normal, CHIP-on-chip s'utilisa per a investigar les interaccions entre les proteïnes i l'ADN in viu. Específicament, permet l'identificació del cistrome, la suma dels llocs d'unió, per a les proteïnes d'unió al ADN en tot el genoma.[1] Es pot realisar un anàlisis del genoma complet per a determinar les ubicacions dels llocs d'unió per a casi qualsevol proteïna d'interés.[1] Com sugerix el nom de la tècnica, tals proteïnes són generalment les que operen en el context de la cromatina. Els representants més destacats d'esta classe són els factors de transcripció, les proteïnes relacionades en la replicació, com la proteïna del complex de reconeiximent d'orige (ORC), les histona, les seues variants i les modificacions de les histona.
L'objectiu de CHIP-on-chip és localisar llocs d'unió a proteïnes que puguen ajudar a identificar elements funcionals en el genoma. Per eixemple, en el cas d'un factor de transcripció com a proteïna d'interés, es poden determinar els seus llocs d'unió al factor de transcripció en tot el genoma. Atres proteïnes permeten l'identificació de regions promotores, potenciadoras, repressores i elements silenciadors, aïllants, elements de frontera i seqüències que controlen la replicació del ADN.[2] Si les histona són un tema d'interés, es creu que la distribució de modificacions i les seues localisacions poden oferir nous coneiximents sobre els mecanismes de regulació.
Un dels objectius a llarc determini per als que es va dissenyar CHIP-on-chip és establir un catàlec d'organismes (seleccionats) que enumere totes les interaccions proteïna-ADN en diverses condicions fisiològiques. Este coneiximent ajudaria en última instància a comprendre la maquinària darrere de la regulació gènica, la proliferació celular i la progressió de la malaltia. Per lo tant, CHIP-on-chip oferix potencial per a complementar el nostre coneiximent sobre l'orquestació del genoma a nivell de nucleòtits i informació sobre nivells més alts d'informació i regulació a mida que es propaga per l'investigació en epigenética.
Plataformes tecnològiques
Les plataformes tècniques per a realisar experiments CHIP-on-chip són les micromatrices de ADN, o "chips". Es poden classificar i distinguir segons vàries característiques:
- Tipo de sonda: les matrius de ADN poden comprendre cDNA o productes de PCR aplicats mecánicament, oligonucleótidos aplicats mecánicamente o oligonucleótidos que se sintetisen in situ. Les primeres versions de microarreglos es varen dissenyar per a detectar ARN de regions genómiques expressades (marcs de llectura oberts, també coneguts com ORF). Encara que dites matrius són perfectament adequades per a estudiar els perfils d'expressió gènica, tenen una importància llimitada en els experiments de CHIP, ya que la majoria de les proteïnes "interessants" sobre esta tècnica s'unixen en regions intergénicas. Hui en dia, inclús les matrius fetes a mida es poden dissenyar i ajustar per a que coincidixquen en els requisits d'un experiment. Ademés, es pot sintetisar qualsevol seqüència de nucleòtits per a cobrir regions gèniques i intergénicas.
- Tamany de la sonda: la versió anterior de les matrius de cDNA tenia una llongitut de sonda d'aproximadament 200 pb. Les últimes versions de matriu utilisen oligos des de 70- (Microarrays, Inc.) fins a 25-mers (Affymetrix).
- Composició de la sonda: Hi ha matrius de ADN en mosaic i sense mosaic. Les matrius sense teselas utilisen sondes seleccionades segons criteris no espacials, és dir, les seqüències de ADN utilisades com sondes no tenen distàncies fixes en el genoma. No obstant, les matrius en mosaic seleccionen una regió genómica (o inclús un genoma complet) i la dividixen en parts iguals. Tal regió es diu ruta en mosaic. La distancia promig entre cada parell de fragments veïns (mida des del centre de cada fragment) dona la resolució de la ruta en mosaic. Una ruta pot estar superposta, d'extrem a extrem o espayada.[3]
- Tamany de la matriu: les primeres micromatrices utilisades per a CHIP-on-Chip contenien al voltant de 13 000 segments de ADN tacat que representaven tots els ORF i les regions intergéniques del genoma del rent.[2]
Fluix de treball d'un experiment de chip en chip
Un experiment CHIP-on-chip es pot dividir en tres passos principals: el primer és configurar i dissenyar l'experiment seleccionant la matriu i el tipo de sonda apropiats. En segon lloc, l'experiment real es realisa en el laboratori humit. Per últim, durant la part de laboratori sec del cicle, les senyes recopilades s'analisen per a respondre a la pregunta inicial o generar noves preguntes per a que el cicle puga escomençar de nou.
Part del fluix de treball Wet-lab
En el primer pas, la proteïna d'interés (POI) es entrecreua en el lloc de ADN al que s'unix en un entorn in vitro. Per lo general, açò es fa per mig d'una fixació suau en formaldehit que és reversible en calor.
Després, les cèlules es lisan i el ADN es talla per mig de sonicación o usant nucleasa microcócica. Açò dona com resultat fragments de ADN de doble cadena, normalment d'1 kb o menys de llongitut. Els que es varen entrecreuar en el POI formen un complex POI-ADN.
En el següent pas, solament estos complexos es filtren del conjunt de fragments de ADN, utilisant un anticòs específic per al POI. Els anticossos poden estar units a una superfície sòlida, poden tindre una perla magnètica o alguna atra propietat física que permeta la separació de complexos entrecreuats i fragments no units. Este procediment és essencialment una inmunoprecipitación (IP) de la proteïna. Açò es pot fer usant una proteïna etiquetada en un anticòs contra l'etiqueta (per eixemple: FLAG, HA, c-myc) o en un anticòs contra la proteïna nativa.
L'entrecreuat dels complexos POI-DNA s'invertix (normalment per mig de calfament) i els bri de DNA es purifiquen. Per al restant del fluix de treball, el PDI ya no és necessari.
Despuix d'un pas d'amplificament i desnaturalisació, els fragments de ADN monocatenario s'etiqueten en una etiqueta fluorescent com Cy5 o Alexa 647.
Finalment, els fragments s'aboquen sobre la superfície de la micromatriz de ADN, que es taca en seqüències curtes monocatenarias que cobrixen la porció genómica d'interés. Cada volta que un fragment marcat "troba" un fragment complementari en la matriu, es hibridarán i formaran novament un fragment de ADN de doble cadena.
Part del fluix de treball Dry-lab
Despuix d'un marc de temps suficientment llarc per a permetre l'hibridació, la matriu s'allumena en llum fluorescent. Eixes sondes en la matriu que es hibridan en un dels fragments etiquetats emeten una senyal de llum que és capturada per una cambra. Esta image conté totes les senyes sense processar de la partix restant del fluix de treball.
Estes senyes sense processar, codificats com una image de color fals, deuen convertir-se a valors numèrics ans que es puga realisar l'anàlisis real. L'anàlisis i l'extracció d'informació de les senyes sense processar a sovint seguix sent la part més desafiant dels experiments de chip en chip. Sorgixen problemes a lo llarc d'esta part del fluix de treball, que van des de la llectura inicial del chip fins als métodos adequats per a sostraure el soroll de fondo i, finalment, els algoritmes apropiats que normalisen les senyes i els posen a disposició per al anàlisis estadístic posterior, que després, en sòrt, conduïxen a una millor comprensió de la qüestió biològica que l'experiment busca abordar. Ademés, per les diferents plataformes d'apanys i la falta d'estandardisació entre elles, l'almagasenament i intercanvi de senyes és un gran problema. En térmens generals, l'anàlisis de senyes es pot dividir en tres passos principals:
Durant el primer pas, les senyals de fluorescència capturades de la matriu es normalisen per mig de senyals de control derivades del mateix chip o d'un segon chip. Estes senyals de control indiquen qué sondes de la matriu es hibridaron correctament i quins es varen unir de forma no específica.
En el segon pas, s'apliquen proves numèriques i estadístiques a les senyes de control i les senyes de fraccions de IP per a identificar regions enriquides en POI a lo llarc del genoma. Els següents tres métodos s'utilisen àmpliament: ranc percentil mijà, error de matriu única i finestra deslisant. Estos métodos generalment diferixen en cóm es manegen les senyals de baixa intensitat, quant soroll de fondo s'accepta i quina traça de les senyes s'emfatisa durant el càlcul. En el passat recent, l'enfocament de finestra deslisant sembla ser el favorit i, a sovint, es descriu com el més poderós.
En el tercer pas, estes regions s'analisen més a fondo. Si el POI fora un factor de transcripció, tals regions representarien els seus llocs d'unió. Després, l'anàlisis posterior pugues voler inferir motius de nucleòtits i atres patrons per a permetre l'anotació funcional del genoma.[4]
Referències
- ↑ 1,0 1,1 Aparicio, O; Geisberg, {{{nom2}}}; Struhl, {{{nom3}}} (2004). Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vixc, University of Southern Califòrnia, Los Angeles, Califòrnia, USA: John Wiley & Sons, Inc., pp. Unit 17.7. doi:10.1002/0471143030.cb1707s23. ISBN 978-0-471-14303-1.
- ↑ 2,0 2,1 (2004).«CHIP-chip: Considerations for the design, analysis, and application of genome-wide chromatin immunoprecipitation experiments».Genomics.83(3)
- 349–360.doi:10.1016/j.ygeno.2003.11.004.
- ↑ (2005).«Issues in the analysis of oligonucleotide tiling microarrays for transcript mapping».Trends in Genetics.21(8)
- 466–475.doi:10.1016/j.tig.2005.06.007.
- ↑ «Biomedical Genomics Core - The Research Institute at Nationwide Children's Hospital». genomics.nchresearch.org.
- Este artícul conté una traducció derivada de «ChIP-on-chip» de Wikipedia en castellà publicada baix la Llicència de documentació lliure de GNU i la Llicència Creative Commons Reconeiximent-CompartirIgual 4.0 Internacional.