Biologia química

La biologia química és una disciplina científica que comprén els camps de la química i la biologia. La disciplina implica l'aplicació de tècniques químiques, anàlisis i, a sovint, menudes molècules produïdes a través de la química sintètica, aixina com a l'estudi i manipulació de sistemes biològics. A diferència de la bioquímica, que implica l'estudi de la química de les biomoléculas i la regulació de les vies bioquímiques dins de les cèlules i entre elles, la biologia química s'ocupa de la química aplicada a la biologia (síntesis de biomoléculas, simulació de sistemes biològics, etc.).

Introducció

Algunes formes de biologia química intenten respondre a les preguntes biològiques sondejant directament els sistemes vius a nivell químic. A diferència de l'investigació que utilisa la bioquímica, la genètica o la biologia molecular, en la que la mutagénesis pot proporcionar una nova versió de l'organisme, la cèlula o la biomolécula d'interés, la biologia química sondeja sistemes in vitro i in viu en menudes molècules que han segut dissenyades per a un propòsit específic o identificades sobre la base d'un erejat bioquímic o celular (vore la genètica química).

La biologia química és una de les diverses ciències interdisciplinàries que tendixen a diferir dels camps més antics i reduccionistas i els objectius dels quals són conseguir una descripció del holismo científic. La biologia química té raïls científiques, històriques i filosòfiques en la química mèdica, la química supramolecular, la química bioorgánica, la farmacologia, la genètica, la bioquímica i la ingenieria metabòlica.

Sistemes d'interés

Tècniques d'enriquiment per a la proteómica

Els biòlecs químics treballen per a millorar la proteómica per mig del desenroll d'estratègies d'enriquiment, etiquetes d'afinitat química i noves sondes. Les mostres per a la proteómica solen contindre moltes seqüències de péptidos i la seqüència d'interés pot estar molt representada o ser de baixa abundància, lo que crea una barrera per a la seua detecció. Els métodos de biologia química poden reduir la complexitat de les mostres per mig de l'enriquiment selectiu utilisant la cromatografía d'afinitat. Açò implica la detecció d'un péptido en una característica distintiva, com una etiqueta de biotina o una modificació post-traducció. S'han desenrollat métodos que inclouen l'us d'anticossos, lectina per a capturar glicoproteína i ions metàlics immovilisats per a capturar péptidos fosforilados i substrats d'enzimes per a capturar enzimes seleccionades.

Sondes enzimàtiques

Per a investigar l'activitat enzimàtica en contraposició a la proteïna total, s'han desenrollat reactius basats en l'activitat per a etiquetar la forma enzimáticamente activa de les proteïnes (vore Proteómica basada en l'activitat). Per eixemple, els inhibidors de la hidrolasa de la serina i la proteasa de la cisteína s'han convertit en inhibidors del suïcidi. Esta estratègia aumenta la capacitat d'analisar selectivament els components de baixa abundància per mig de la selecció directa. L'activitat de les enzimes també pot ser monitoreada a través del substrat convertit. L'identificació dels substrats de les enzimes és un problema de gran dificultat en la proteómica i és vital per a la comprensió de les vies de transducción de senyals en les cèlules. Un método que s'ha desenrollat utilisa cinasas «sensibles als anàlecs» per a etiquetar els substrats utilisant un anàlec de el ATP no natural, facilitant la visualisació i l'identificació a través d'un mànec únic.

Glicobiología

Si ben el ADN, el ARN i les proteïnes estan codificats a nivell genètic, els glicanos (polímero de sucre) no estan codificats directament des del genoma i hi ha menys ferramentes disponibles per al seu estudi. Per tant, la glicobiología és una esfera d'investigació activa per als biòlecs químics. Per eixemple, es pot suministrar a les cèlules variants sintètiques de sucres naturals per a investigar la seua funció. El grup d'investigació de Carolyn Bertozzi ha desenrollat métodos per a que les molècules de la superfície de les cèlules reaccionen de forma específica en cada lloc a través de sucres sintètics.

Química combinatòria

Els biòlecs químics varen utilisar la síntesis automatizado de diverses biblioteques de molècules chicotetes per a realisar anàlisis d'alt rendiment dels processos biològics. Tals experiments poden conduir al descobriment de chicotetes molècules en propietats antibióticas o quimioterapéuticas. Estos enfocaments de química combinatoria són idèntics als empleats en la disciplina de la farmacologia.

Amprant la biologia

Molts programes d'investigació també se centren en l'ocupació de biomoléculas naturals per a realisar tasques biològiques o per a recolzar un nou método químic. En este sentit, els investigadors de la biologia química han demostrat que el ADN pot servir com a plantilla per a la química sintètica, les proteïnes autoensambladas poden servir com andamiaje estructural per a nous materials, i el ARN pot evolucionar in vitro per a produir una nova funció catalítica. Ademés, les chicotetes molècules sintètiques heterobifuncionales (de dos cares), com els dimerizadores o els PROTAC, unixen dos proteïnes en l'interior de les cèlules, lo que pot induir sintéticamente noves i importants funcions biològiques, com la degradació de proteïnes específiques.

Síntesis de péptidos

La síntesis química de les proteïnes és una ferramenta valiosa en la biologia química, ya que permet l'introducció d'aminoàcits no naturals, aixina com l'incorporació específica de residus de «modificacions postraduccionales» com la fosforilación, la glicosilación, la acetilación i inclús la ubiqüitat. Estes capacitats són valioses per als biòlecs químics, ya que els aminoàcits no naturals poden utilisar-se per a investigar i alterar la funcionalitat de les proteïnes, mentres que les modificacions postraduccionales són àmpliament conegudes per regular l'estructura i l'activitat de les proteïnes. Encara que s'han desenrollat tècniques estrictament biològiques per a conseguir estos fins, la síntesis química dels péptidos sol tindre una barrera tècnica i pràctica menor per a obtindre chicotetes cantitats de la proteïna desijada.

Per a crear cadenes de polipèptits del tamany d'una proteïna a través dels menuts fragments de péptidos obtinguts per síntesis, els biòlecs químics utilisen el procés de lligam química nativa. La lligam química nativa implica l'acoplament d'un tioéster C-terminal i un residu d'cisteína N-terminal, lo que finalment resulta en la formació d'un enllaç de amida «natiu». Atres estratègies que s'han utilisat per a la lligam de fragments de péptidos per mig de la química de transferència de acilos introduïda per primera volta en la lligam química nativa són la lligam de proteïnes expressades, les tècniques de sulfurización/desulfurización i l'us d'auxiliars de tiol extraíbles. La lligam de proteïnes expressades permet l'instalació biotecnológica d'un tioéster C-terminal utilisant inteínas, lo que permet l'apèndix d'un péptido N-terminal sintètic a la porció C-terminal produïda recombinantemente. Tant les tècniques de sulfurización/desulfurización com l'us d'auxiliars de tiol extraíbles impliquen l'instalació d'una fracció de tiol sintètic per a portar a terme la química de lligam química nativa estàndar, seguida de l'eliminació de l'auxiliar/tiol.

Evolució dirigida

Un objectiu primordial de la ingenieria de proteïnes és el disseny de nous péptidos o proteïnas en una estructura i activitat química desijades. Degut a que el nostre coneiximent de la relació entre la seqüència primària, l'estructura i la funció de les proteïnes és llimitat, el disseny racional de noves proteïnes en activitats d'ingenieria és extremadament desafiant. En la evolució dirigida, els cicles repetits de diversificació genètica seguits d'un procés de selecció o erejat, poden utilisar-se per a imitar la selecció natural en el laboratori per a dissenyar noves proteïnes en una activitat desijada.

Existixen varis métodos per a crear grans biblioteques de variants de seqüències. Entre els més utilisats es troben la sumissió del ADN a la radiació UV o a mutagénicos químics, la PCR propensa a errors, els codones degenerados o la recombinació. Una volta que es crea una gran biblioteca de variants, s'utilisen tècniques de selecció o erejat per a trobar mutantes en un atribut desijat. Entre les tècniques de selecció o erejat més comunes s'inclouen el FACS, la visualisació de el ARNm, la visualisació de fagos i la compartimentació in vitro. Una volta que es troben variants útils, la seua seqüència de ADN s'amplifica i se somet a noves rondes de diversificació i selecció.

El desenroll dels métodos d'evolució dirigida va ser honrat en 2018 en la concessió del Premi Nobel de Química a Frances Arnold per l'evolució de les enzimes, i a George Smith i Gregory Winter per la visualisació de fagos.

Reaccions bio-ortogonals

L'èxit en l'etiquetage d'una molècula d'interés requerix una funcionalización específica d'eixa molècula per a que reaccione químicament en una sonda òptica. Per a que un experiment d'etiquetage es considere robust, eixa funcionalización deu pertorbar mínimament el sistema. Llamentablement, estos requisits solen ser difícils de complir. Moltes de les reaccions de les que normalment disponen els químics orgànics en el laboratori no estan disponibles en els sistemes vius. Les reaccions sensibles a l'aigua i al redox no es produirien, els reactius propensos a l'atac nucleófilo no oferirien cap quimioespecificitat i qualsevol reacció en grans barreres cinètiques no trobaria suficient energia en l'entorn de calor relativament baixa d'una cèlula viva. Aixina que, els químics han desenrollat recentment un panel de química bioortogonal que procedix químicament, a pesar de l'entorn de materials reactius de distracció in viu.

L'acoplament d'una sonda a una molècula d'interés deu produir-se en un determini raonablement curt; per lo tant, la cinètica de la reacció d'acoplament deu ser molt favorable. La química del clic és molt adequada per a omplir esta caseta, ya que les reaccions de clic són ràpides, espontànees, selectives i d'alt rendiment. Desafortunadament, la més famosa «reacció de clic», una cicatrisació [3+2] entre una azida i un alquino acíclic, està catalizada pel coure, lo que planteja un sério problema per al seu us in viu per la toxicitat del coure. Per a evitar la necessitat d'un catalisador, el laboratori de Carolyn R. Bertozzi va introduir un cep inherent en l'espècie de alquinos utilisant un alquino cíclico. En particular, el ciclocino reacciona en molècules de azido en un vigor distintiu.

El método més comú d'instalar la reactivitat bioortogonal en una biomolécula objectiu és a través de l'etiquetage metabòlic. Les cèlules se sumergixen en un mig en el que l'accés als nutrients es llimita als anàlecs sintètics modificats dels combustibles estàndar, com els sucres. Com a conseqüència, estes biomoléculas alterades s'incorporen a les cèlules de la mateixa manera que els metabòlits no modificats. A continuació, s'incorpora una sonda al sistema per a obtindre una image del destí de les biomoléculas alterades. Atres métodos de funcionalización inclouen l'inserció enzimàtica d'azidas en les proteïnas i la síntesis de fosfolípits conjugats en cicloctilos.

Descobriment de biomoléculas a través de la metagenómica

Els alvanços en les modernes tecnologies de seqüenciació a finals del deceni de 1990 varen permetre als científics investigar el ADN de les comunitats d'organismes en el seu entorn natural («eDNA»), sense cultivar espècies individuals en el laboratori. Este enfocament metagenómico va permetre als científics estudiar una àmplia selecció d'organismes que abans no es caracterisaven degut en part a una condició de creiximent incompetent. Entre les fonts de eDNA figuren els sols, l'oceà, el subsol, les fonts termals, les fonts hidrotermales, els conyes polars, els hàbitats hipersalinos i els entorns de pH extrem. De les moltes aplicacions de la metagenómica, investigadors com Jo Handelsman, Jon Clardy i Robert M. Goodman, varen explorar enfocaments metagenómicos per al descobriment de molècules biològicament actives com els antibiòtics.

Overview of metagenomic methods

Visió general dels métodos metagenómicos

S'han utilisat estratègies d'evaluació funcional o homológica per a identificar els gens que produïxen chicotetes molècules bioactivas. Els estudis de metagenómica funcional estan dissenyats per a buscar fenotips específics que s'associen en molècules en característiques específiques. Els estudis metagenómicos d'homologia, per una atra part, estan dissenyats per a examinar els gens a fi d'identificar les seqüències conservades que estan prèviament associades en l'expressió de molècules biològicament actives.

Els estudis metagenómicos funcionals permeten descobrir nous gens que codifiquen molècules biològicament actives. Estos ensajos inclouen ensajos de superposició de agar superior en els que els antibiòtics generen zones d'inhibició del creiximent contra els microbis de prova, i ensajos de pH que poden detectar el canvi de pH per les molècules recent sintetisades utilisant l'indicador de pH en una placa d'agar. La detecció de l'expressió de gens induïda per substrats (SIGEX), un método de detecció de l'expressió de gens induïts per composts químics, també s'ha utilisat per a buscar gens en funcions específiques. Els estudis metagenómicos basats en l'homologia han permés descobrir ràpidament gens que tenen seqüències homòlogues als gens anteriorment coneguts que són responsables de la biosíntesis de les molècules biològicament actives. Tan pronte com es secuencian els gens, els científics poden comparar mils de genomes bacterians simultàneament. La ventaja sobre els ensajos de metagenómica funcional és que els estudis de metagenómica homòloga no requerixen un sistema d'organisme amfitrió per a expressar els metagenomas, per lo que este método pot aforrar potencialment el temps dedicat a analisar genomes no funcionals. Açò també va conduir al descobriment de vàries proteïnes noves i chicotetes molècules. Ademés, un examen in silico de l'Estudi Metagenómico Mundial de l'Oceà va trobar 20 noves ciclasas lantibióticas.

Kinasas

La modificació postraduccional de les proteïnes en grups de fosfat per les cinasas és un pas regulador clau en tots els sistemes biològics. Els events d'fosforilación, ya siga la fosforilación per cinasas de proteïnes o la desfosforilación per fosfatasas, donen lloc a l'activació o desactivació de les proteïnes. Estos events tenen un impacte en la regulació de les vies fisiològiques, lo que fa que la capacitat de dissecció i estudi d'estes vies siga essencial per a comprendre els detalls dels processos celulars. Hi ha una série de problemes —a saber, el mer tamany del fosfoproteoma, la naturalea fugaç dels acontenyiments d'fosforilación i les llimitacions físiques conexas de les tècniques biològiques i bioquímiques clàssiques— que han llimitat l'alvanç dels coneiximents en esta esfera.

Per mig de l'us de menuts moduladors de molècules de proteïnes cinasas, els biòlecs químics han conseguit comprendre millor els efectes de la fosforilación de les proteïnes. Per eixemple, els inhibidors de la cinasa no selectius i selectius, com una classe de composts de piridinilimidazol, són potents inhibidors útils en la dissecció de les vies de senyalisació de la cinasa MAP. Estos composts de piridinilimidazol funcionen apuntant a la bossa d'unió del ATP. Encara que este enfocament, aixina com atres enfocaments conexos, en llaugeres modificacions, han demostrat la seua eficàcia en varis casos, estos composts carixen de la especificitat adequada per a aplicacions més generals. Una atra classe de composts, els inhibidors basats en mecanismes, combina el coneiximent de la enzimología de la cinasa en motius d'inhibició utilisats anteriorment. Per eixemple, un «anàlec de bisubstrato» inhibix l'acció de la cinasa en unir tant la bossa d'unió de ATP conservada com un lloc de reconeiximent de proteïnes i péptidos en la cinasa específica. Els grups d'investigació també varen utilisar els anàlecs de el ATP com sondes químiques per a estudiar les cinasas i identificar els seus substrats.

El desenroll de nous mijos químics per a incorporar els aminoàcits fosfomiméticos en les proteïnes ha proporcionat una important comprensió dels efectes dels acontenyiments d'fosforilación. Els events d'fosforilación s'han estudiat típicament mutando un lloc d'fosforilación identificat (serina, treonina o tirosina) a un aminoàcit, com la alanina, que no pot ser fosforilado. No obstant, estes tècniques tenen llimitacions i els biòlecs químics han desenrollat formes millorades d'investigar la fosforilación de les proteïnes. Per mig de l'instalació de mímicas de fosforeína, fosfotrionina o fosfonato anàlec en les proteïnes natives, els investigadors poden realisar estudis in viu per a investigar els efectes de la fosforilación, estenent la cantitat de temps en que es produïx un event d'fosforilación i minimisant els efectes, a sovint desfavorables, de les mutacions. La lligam de proteïnes expressades, ha demostrat ser una tècnica exitosa per a produir sintéticamente proteïnes que contenen molècules fosfomiméticas en qualsevol de les dos terminals. Ademés, els investigadors han utilisat la mutagénesis d'aminoàcits antinaturals en els llocs elegits dins d'una seqüència peptídica.

Els alvanços en biologia química també han millorat les tècniques clàssiques d'image de l'acció de la cinasa. Per eixemple, el desenroll de biosensorés peptídicos —péptidos que contenen fluoróforos incorporats— va millorar la resolució temporal dels ensajos d'unió in vitro. Una de les tècniques més útils per a estudiar l'acció de la cinasa és la FRET. Per a utilisar FRET per a estudis d'fosforilación, les proteïnes fluorescents estan acoplades tant a un domini d'unió de fosfoaminoácidos com a un péptido que pot ser fosforilado. Al fosforilar o desfosforilar un péptido substrat, es produïx un canvi de conformació que resulta en un canvi en la fluorescència. El FRET també s'ha utilisat en tàndem en la Microscopia d'Imàgens de Fluorescència durant la Vida (FLIM) o en anticossos conjugats fluorescentemente i en la citometría de fluix per a proporcionar resultats quantitatius en una excelent resolució temporal i espacial.

Fluorescència biològica

Els biòlecs químics solen estudiar les funcions de les macromolécula biològiques per mig de tècniques de fluorescència. La ventaja de la fluorescència front a atres tècniques residix en la seua alta sensibilitat, la seua no invasividad, la seua detecció segura i la seua capacitat per a modular la senyal de fluorescència. En els últims anys, el descobriment de la proteïna verda fluorescent (GFP) per Roger Y. Tsien i uns atres, els sistemes híbrits i els punts quàntics han permés evaluar en major precisió l'ubicació i la funció de les proteïnes. S'utilisen tres tipos principals de fluoróforos: chicotetes tenyides orgàniques, proteïnes verdes fluorescents i punts quàntics. Les chicotetes tenyides orgàniques solen ser de menys d'1 kDa, i s'han modificat per a aumentar la fotoestabilidad i la lluentor, i reduir el autoapagado. Els punts quàntics tenen llongituts d'ona molt agudes, alta absorció molar i rendiment quàntic. Tant les tenyides orgàniques com les tenyides quàntiques no tenen la capacitat de reconéixer la proteïna d'interés sense l'ajuda d'anticossos, per lo que deuen utilisar el inmunoetiquetado. Les proteïnes fluorescents estan genèticament codificades i poden fusionar-se en la proteïna d'interés. Una atra tècnica de marcat genètic és el sistema biarsenical de tetracisteína, que requerix la modificació de la seqüència objectiu que inclou quatre cisteína, que s'unixen a les molècules biarsenicales permeables a la membrana, els colorants vert i roig «FlAsH» i «ReAsH», en afinitat picomolar. Tant les proteïnes fluorescents com la tetracisteína biarsenical poden expressar-se en cèlules vives, pero presenten grans llimitacions en l'expressió ectópica i podrien causar una pèrdua de funció.

S'han utilisat tècniques fluorescents per a evaluar una série de dinàmiques de les proteïnes, com el seguiment de les proteïnes, els canvis de conformació, les interaccions entre proteïnes, la síntesis i la renovació de les proteïnes i l'activitat de les enzimes, entre unes atres. Tres enfocaments generals per a medir la redistribució i difusió de la ret de proteïnes són el rastreig d'una sola partícula, l'espectroscòpia de correlació i els métodos de fotomarcado. En el seguiment d'una sola partícula, la molècula individual deu ser lo suficientment lluenta i dispersa com per a ser rastrejada d'un vídeo a un atre. L'espectroscòpia de correlació analisa les fluctuacions d'intensitat resultants de la migració d'objectes fluorescents cap a i des d'un chicotet volum en el foc d'un làser. En el fotomarcado, una proteïna fluorescent pot ser secuenciada en un àrea subcelular en l'us d'un intens allumenament local i el destí de la molècula marcada pot ser visualisat directament. Michalet i els seus companyers de treball varen utilisar punts quàntics per al seguiment d'una sola partícula usant punts quàntics de biotina en les cèlules HeLa. Una de les millors maneres de detectar canvis conformacionales en les proteïnes és etiquetar la proteïna d'interés en dos fluoróforos en estreta proximitat. FRET respondrà als canvis conformacionales interns resultants de la reorientació d'un fluoróforo sobre l'atre. També es pot utilisar la fluorescència per a visualisar l'activitat de les enzimes, típicament utilisant una proteómica basada en l'activitat asseciada (qABP). L'unió covalente d'una qABP al lloc actiu de l'enzima objectiu proporcionarà evidència directa sobre si l'enzima és responsable de la senyal en lliberar el apagador i recuperar la fluorescència.