Espectroscòpia de fluorescència

L'espectroscòpia de fluorescència, també cridada fluorimetría^{cita requerida}; és un tipo d'espectroscòpia basada en l'emissió fluorescent d'una mostra. Açò involucra l'us d'un fes de llum, comunament de llum ultravioleta, que excita als electrons en certes molècules o àtoms i causa l'emissió de, típica pero no necessàriament, llum visible. L'equipament que medix la fluorescència és cridat fluorómetro o fluorímetro.

Espectroscòpia de fluorescència

Espectres de fluorescència de rubí a 1 atm, 2,23 GPa i 4 GPa,

Teoria

Les molècules tenen varis estats referits als nivells d'energia. L'espectroscòpia de fluorescència es preocupa fonamentalment d'estats electrònics i vibratorios. Generalment les espècies estudiades posseïxen un estat fonamental electrònic o estat estacionario (un baix estat electrònic) d'interés, i un estat electrònic excitat d'una energia superior. Dins de cada u d'estos estats electrònics hi ha varis estats vibratorios. En espectroscòpia de fluorescència, les espècies són les primeres en ser excitades per mig de l'absorció d'un fotó, des del seu d'estat electrònic fonamental, a un dels diversos estats vibratorios en l'estat electrònic excitat. Les colisions en atres molècules causen a la molècula excitada la pèrdua d'energia vibratoria fins que alcança el menor estat vibratorio de l'estat electrònic excitat. Este procés és a sovint visualisat en el diagrama de Jablonski. La molècula despuix torna a declinar a un dels varis nivells de vibració de l'estat electrònic fonamental emetent un fotó en el procés. Com les molècules poden decaure en qualsevol dels varis nivells vibratorios en l'estat fonamental, els fotons emesos tindran llavors diferents energies, i d'esta manera diferents freqüències. Per tant, per l'anàlisis de les diferents freqüències de llum emeses en l'espectroscòpia de fluorescència junt en les seues intensitat relatives, l'estructura dels diferents nivells vibratorios pot ser determinada. Per a espècies atòmiques, el procés és similar, no obstant, des d'espècies atòmiques no es posseïxen nivells vibratorios d'energia, els fotons emesos estan en freqüència en la mateixa llongitut d'ona que la radiació incident. Este procés de reemitir el fotó absorbit és cridat “resonància de fluorescència “i encara que és característica de la fluorescència atòmica, s'observa en la fluorescència molecular. En un experiment típic, les diferents llongituts d'ona de llum fluorescent emeses per una mostra es medixen usant un monocromador , sostenint la llum excitada en una llongitut d'ona constant. Açò és cridat espectre d'emissió. Un espectre d'excitació és lo contrari, en est la llum emesa es manté constant en una llongitut d'ona, i la llum d'excitació és llegida per mig de diferents llongituts d'ona (per mig d'un monocromador). Un mapa d'emissió és medit per mig del registre de l'espectre d'emissió resultant d'una gama d'excitació de llongituts d'ona en la combinació de totes estes juntes. Esta és una superfície tridimensional de senyes: l'intensitat d'emissió com una funció de l'excitació i emissió de llongituts d'ona, la qual és típicament representada com un mapa de contorn.

Instrumentació

Existixen dos tipos generals d'instruments:

• Fluorímetro de filtre: L'us d'estos filtres servix per a aïllar l'incidència de llum i la fluorescència de la llum.
• Espectrofluorímetros: Utilisa una ret de difracció de monocromador és per a aïllar l'incidència de la llum i la fluorescència de la llum.

Abdós tipos de filtres usen el següent esquema: La llum procedent d'una font d'excitació passa a través d'un filtre o un monocromador i colpeja la mostra. Una porció de la llum incident és absorbida per la mostra i algunes de les molècules en la mostra fluorescent. La llum fluorescent és emesa en totes les direccions. Algunes d'estes llums fluorescents passen a través d'un segon filtre o un monocromador i alcancen un detector, el qual és usualment colocat a noranta graus de l'incidència del fes de llum per a minimisar el risc de la transmissió o reflex de l'incidència de la llum buscada en el detector.

Vàries fonts de llum poden ser usades com a fonts d'excitació, incloent làsers, fotodiodos i llànties; fars de xenón i llàntia de vapor de mercuri, en particular. Un làser solament emet llum de gran irradiació a una llongitut d'ona molt estreta, típicament per baix de 0.01 nm, el qual fa una excitació del monocromador o filtre necessari. La desventaja d'este método és que la llongitut d'ona del làser no pot ser canviada per una molt gran. Una llàntia de vapor de mercuri és una llínea de llàntia, açò significa que emet llum prop del pic de la llongitut de l'ona. Pel contrari un arc de xenón té contínua emissió de l'espectre en poca intensitat en el ranc de 300-800 nm i suficient irradiació per a la mida just una miqueta més per damunt del de 200 nm.

Els filtres i/o monocromadores poden ser utilisats en fluometría. Un monocromador transmet llum en llongitut d'ona ajustable en la seua respectiva tolerància. El monocromador més comú utilisa una reixeta de difracció, que és la llum colocada per a allumenar la reixeta i ix en un diferent àngul depenent de la llongitut de l'ona. El monocromador pot ser ajustat seleccionant la llongitut d'ona a transmetre. Per a permetre la medició d'anisotropía de dos filtres polarisats són necessaris: un despuix de l'excitació del monocromador o el filtre, i un abans de l'emissió del monocromador o filtre.

Com es va mencionar anteriorment, la fluorescència pot ser medida en un àngul de 90° sobre l'excitació de la llum. Esta geometria s'usa en lloc de colocar el sensor en la llínea d'excitació de la llum a un àngul de 180°, evitant l'interferència de la transmissió de l'excitació de la llum. Un monocromador no és perfecte i podria transmetre alguna llum perduda o dispersa, és dir, la llum en atres llongituts d'ona que les del destí. Un únic ideal monocromador seria el que transmeta la llum en un ranc específic i que tinga una gran llongitut d'ona independent de la transmissió. Quan es medix un àngul de 90°, la llum és dispersada per simples causes de llum difusa.

Estos resultats donen una millor relació senyal-soroll i disminuïx el llímit de detecció aproximadament en un factor de 10 000, quan es compara en la geometria de l'àngul de 180°. Ademés, la fluorescència pot ser també medida des d'avant, en el qual és algunes voltes, o be, térbola o mostres opaques.

El detector pot ser uni-canalisat o multi-canalisat. El detector uni-canalisat pot detectar solament una llongitut d'ona al mateix temps, mentres que el multi-canalizador detecta l'intensitat de totes les llongituts d'ones simultàneament, fent l'emissió del monocromador o del filtre, innecessària. Els diferents tipos de detectors tenen ventages i desventages. La majoria dels fluorímetros són versàtils en un parell de monocromadores i una font d'excitació de llum contínua, estos poden gravar l'excitació d'espectre i la fluorescència de l'espectre, la llongitut d'ona de l'excitació de la llum es manté constant, preferiblement com una gran llongitut d'ona d'absorció, i l'emissió del monocromador explorarà l'espectre. Per a medir l'excitació de l'espectre, la llongitut d'ona passa per mig de l'emissió del filtre o el monocromador és explorat. L'excitació de l'espectre generalment és idèntica a l'absorció de l'espectre, com l'intensitat de la fluorescència és proporcional a l'absorció.