Teoria de la seqüenciació de ADN

La teoria de la seqüenciació de ADN és l'ampli cos de treball que intenta assentar les bases analítiques per a determinar l'orde de nucleòtits específics en una seqüència d'ADN, també coneguda com seqüenciació de ADN. Els aspectes pràctics giren entorn al disseny i l'optimisació de proyectes de seqüenciació (coneguts com "genómica estratègica"), la predicció del rendiment del proyecte, la resolució de problemes dels resultats experimentals, la caracterisació de factors com el biaix de seqüència i els efectes dels algoritmes de processament de software i la comparació de varis métodos de seqüenciació entre sí. En este sentit, podria considerar-se una branca de l'ingenieria de sistemes o l'investigació d'operacions. L'archiu permanent de treball és principalment matemàtic, encara que a sovint també es realisen càlculs numèrics per a problemes particulars. La teoria de la seqüenciació de el ADN aborda els processos físics relacionats en la seqüenciació de el ADN i no deu confondre's en les teories de l'anàlisis de seqüències de ADN resultants, per eixemple, alliniació de seqüències. Les publicacions voltes no fan una distinció cuidadosa, pero estes últimes s'ocupen principalment de qüestions algorítmiques. La teoria de la seqüenciació es basa en elements de les matemàtiques, la biologia i l'ingenieria de sistemes, per lo que és altament interdisciplinària. El tema pot estudiar-se en el context de la biologia computacional.

Teoria i estratègies de seqüenciació

Seqüenciació com a problema de cobertura

Tots els métodos principals de seqüenciació de ADN es basen en la llectura de menuts fragments de ADN i, posteriorment, en la reconstrucció d'estes senyes per a inferir el ADN objectiu original, ya siga per mig d'ensamblage o alliniació en una referència. l'abstracció comuna a estos métodos és la d'un problema matemàtic de cobertura. Per eixemple, un pot imaginar un segment de llínea que represente l'objectiu i un procés posterior en el que es "solten" segments més menuts en ubicacions aleatòries de l'objectiu. L'objectiu es considera "secuenciado" quan s'acumula una cobertura adequada (per eixemple, quan no queden espais).

Les propietats abstractes del recobriment han segut estudiades per matemàtics durant més d'un sigle. No obstant, l'aplicació directa d'estos resultats generalment no ha segut possible. Les solucions matemàtiques de forma tancada, especialment per a distribucions de provabilitat, a sovint no es poden evaluar fàcilment. És dir, impliquen cantitats excessivament grans de temps de computadora per a paràmetros característics de la seqüenciació de el ADN. La configuració de Stevens és un eixemple. Els resultats obtinguts des de la perspectiva de les matemàtiques pures tampoc tenen en conte factors que són realment importants en la seqüenciació, per eixemple, superposició detectable en fragments de seqüenciació, doble bri, efectes de vora i multiplicitat d'objectius. En conseqüència, el desenroll de la teoria de la seqüenciació ha alvançat més d'acort en la filosofia de les matemàtiques aplicades. En particular, s'ha centrat en problemes i fa un us convenient d'aproximacions, simulacions, etc.

Usos primerencs derivats de la teoria de provabilitat elemental

El resultat més primerenc pot obtindre's directament de la teoria de provabilitat elemental. Supongam que modelem el procés anterior prenent___MATH_0___ i___MATH_1___ com la llongitut del fragment i la llongitut objectiu, respectivament. La provabilitat de "cobrir" qualsevol ubicació donada en l'objectiu en un fragment en particular és llavors___MATH_2___. (Açò supon___MATH_3___, que és vàlit a sovint, pero no per a tots els casos del món real.) La provabilitat de que un sol fragment no cobrixca una ubicació determinada en l'objectiu és, per tant,___MATH_4___ i___MATH_5___ per a___MATH_6___ fragments. Per tant, la provabilitat de cobrir una ubicació determinada de l'objectiu en a lo manco un fragment és

___MATH_7___

Esta equació es va utilisar per primera volta per a caracterisar biblioteques de plásmidos pero pot aparéixer en una forma modificada. Per a la majoria de proyectes ___MATH_8___, de modo que, en un bon grau d'aproximació

___MATH_9___

a on ___MATH_10___ es diu redundància. Tinga en conte l'importància de la redundància com a representació del número promig de voltes que una posició es cobrix en fragments. Tinga en conte també que en considerar el procés de cobertura en totes les posicions en l'objectiu, esta provabilitat és idèntica al valor esperat de la variable aleatòria ___MATH_11___, la fracció de la cobertura objectiu. El resultat final,

___MATH_12___

seguix sent d'us generalisat com un estimador de "revers del sobre" i prediu que la cobertura per a tots els proyectes evoluciona a lo llarc d'una curva universal que és una funció solament de la redundància.

Teoria de Lander-Waterman

En 1988, Eric Lander i Michael Waterman varen examinar el problema de la cobertura des del punt de vista dels estanys. Encara que es varen centrar en el problema del mapage, l'abstracció de la seqüenciació és molt pareguda. Varen proporcionar una série de resultats útils que es varen adoptar com teoria estàndar des dels primers dies de la seqüenciació del genoma "a gran escala".enoma Humà i continua eixercitant un paper important en la seqüenciació de el ADN.

En última instància, l'objectiu principal d'un proyecte de seqüenciació és tancar totes les breches, per lo que la "perspectiva de la brecha" va ser una base llògica per a desenrollar un model de seqüenciació. Un dels resultats d'este model més utilisats és el número esperat de cóntigos, donat el número de fragments secuenciados. Si un descuida la cantitat de seqüència que és essencialment "desperdiciada" en tindre que detectar superposicions, la seua teoria cedix

___MATH_13___

En 1995, Roach va publicar millores a esta teoria, lo que li va permetre aplicar-la a proyectes de seqüenciació en els que l'objectiu era secuenciar completament un genoma objectiu. Michael Wendl i Bob Waterston varen confirmar, basant-se en el método de Stevens, que abdós models varen produir resultats similars quan el número de contigs era substancial, com en proyectes de seqüenciació o mapage de baixa cobertura. A mida que els proyectes de seqüenciació es varen intensificar en la década de 1990 i els proyectes s'acostaven a la seua finalisació, les aproximacions de baixa cobertura es varen tornar inadequades i es necessitava el model exacte de Roach. No obstant, a mida que va disminuir el cost de la seqüenciació, els paràmetros dels proyectes de seqüenciació es varen tornar més fàcils de provar directament de manera empírica i l'interés i la finançació de la genómica estratègica varen disminuir.

Les idees bàsiques de la teoria de Lander-Waterman varen dur a una série de resultats adicionals per a variacions particulars en les tècniques de mapage. No obstant, els alvanços tecnològics han fet que les teories cartogràfiques siguen en gran mida obsoletes, llevat en organismes distints dels organismes modele altament estudiats (per eixemple, rent, mosques, rates i humans).

Estratègia d'estacionament

L'estratègia d'estacionament per a secuenciar s'assembla al procés d'estacionar autos a lo llarc d'una acera. Cada coche és un clon secuenciado i l'acera és l'objectiu genómico. Cada clon secuenciado s'ereja per a assegurar que els clons secuenciados posteriorment no es solapen en cap clon secuenciado prèviament. Cap esforç de seqüenciació és redundante en esta estratègia. No obstant, de la mateixa manera que els espais entre autos estacionats, els espais no secuenciados menors que la llongitut d'un clon s'acumulen entre els clons secuenciados. Pot haver un cost considerable per a tancar eixes breches.

Seqüenciació final per parells

En 1995, es va propondre i va demostrar per mig de simulacions una generalisació d'un conjunt d'estratègies explorades anteriorment. Este método de seqüenciació del genoma complet es va fer inmensamente popular. Hui en dia, la majoria dels proyectes de seqüenciació ampren esta estratègia, a sovint denominada seqüenciació d'extrems emparellats.

Alvanços posteriors al Proyecte Genoma Humà

Els processos físics i els protocols de seqüenciació de el ADN han seguit evolucionant, impulsats en gran mida pels alvanços en els métodos bioquímics, l'instrumentació i les tècniques d'automatisació. En l'actualitat, existix una àmplia gama de problemes en els que la seqüenciació de ADN s'ha obert camí, inclosa la metagenómica i la seqüenciació mèdica (càncer). Hi ha factors importants en estos escenaris que la teoria clàssica no té en conte. El treball recent ha començat a centrar-se en resoldre els efectes d'alguns d'estos problemes. El nivell de matemàtiques es torna proporcionalment més sofisticat.

Varis artefactes de seqüenciació de insertos grans

Els biòlecs han desenrollat métodos per a filtrar regions de genomes altament repetitives i essencialment no secuenciables. Estos procediments són importants per a organismes els genomes dels quals consistixen principalment en dit ADN, per eixemple, dacsa. Produïxen multitut de chicotetes illes de productes de ADN secuenciables. Wendl i Barbazuk varen propondre una extensió de la teoria de Lander-Waterman per a tindre en conte les "breches" en l'objectiu pel filtrat i el cridat "efecte de vora". Este últim és un biaix de mostreig específic de la posició, per eixemple, la posició base del terminal té solament una ___MATH_14___ possibilitat de ser cobert, a diferència de ___MATH_15___ per a posicions interiors. Per a ___MATH_16___, la teoria clàssica de Lander-Waterman encara oferix bones prediccions, pero la dinàmica canvia per a obtindre redundància més altes.

Els métodos de seqüenciació moderns solen secuenciar abdós extrems d'un fragment més gran, lo que proporciona informació d'enllaç per a l'ensamblage de novo i millors provabilitats d'alliniació en la seqüència de referència. Els investigadors generalment creuen que les llongituts de senyes més llargues (llongituts de llectura) milloren el rendiment dels objectius de ADN molt grans, una idea coherent en les prediccions dels models de distribució. No obstant, Wendl va mostrar que els fragments més menuts proporcionen una millor cobertura en objectius llineals menuts perque reduïxen l'efecte de vora en molècules llineals. Estes troballes tenen implicacions per a la seqüenciació dels productes dels procediments de filtrat de ADN. El emparejamiento de llectures i el tamany dels fragments tenen evidentment una influència insignificant per als objectius de classe grans de genoma complet.

Seqüenciació individual i poblacional

La seqüenciació està emergint com una ferramenta important en medicina, per eixemple en l'investigació del càncer. Ací, la capacitat de detectar mutacions heterocigotas és important i açò solament es pot fer si s'obté la seqüència del genoma diploide. En els esforços pioners per a secuenciar individus, Levy et al. i Wheeler et al., qui secuenció a Craig Venter i Jim Watson, respectivament, va descriure models per a cobrir abdós alels en un genoma. Wendl i Wilson varen seguir en una teoria més general que permetia un número arbitrari de cobertes de cada alel i una ploidía arbitrària. Estos resultats apunten a la conclusió general de que la cantitat de senyes necessàries per a tals proyectes és significativament major que la dels proyectes haploides tradicionals. Generalment, ara és estàndar una redundància d'a lo manco 30 voltes, és dir, cada nucleòtit comprés per un promig de 30 llectures de seqüència. No obstant, els requisits poden ser inclús majors, depenent dels tipos d'events genómicos que es troben. Per eixemple, en el cridat "método de parells de llectura discordantes", es poden inferir insercions de ADN si la distància entre parells de llectura és major de lo esperat. Els càlculs mostren que es necessita una redundància d'al voltant de 50 voltes per a evitar errors de fals positiu en un llindar del 1%.

El advenimiento de la seqüenciació de pròxima generació també ha fet factible la seqüenciació de poblacions a gran escala, per eixemple, el Proyecte 1000 Genomes per a caracterisar la variació en grups de població humana. Si be la variació comuna es captura fàcilment, la variació rara planteja un desafiu de disseny: molt poques mostres en una redundància de seqüència significativa corre el risc de no tindre una variant en el grup de mostra, pero les mostres grans en una redundància lleu no capturen una variant en el conjunt de llectura que realment està en el grup de mostra. Wendl i Wilson informen d'un conjunt simple de regles d'optimisació que maximizar la provabilitat de descobriment per a un conjunt donat de paràmetros. Per eixemple, per a observar un alel rar a lo manco dos voltes (per a eliminar la possibilitat és única d'un individu), es deu usar una redundància d'una miqueta menys de 4 voltes, independentment del tamany de la mostra.

Seqüenciació metagenómica

Els instruments de pròxima generació ara també permeten la seqüenciació de comunitats metagenómicas no cultivades sanceres. L'escenari de seqüenciació és més complicat ací i hi ha vàries formes d'emmarcar les teories de disseny per a un proyecte donat. Per eixemple, Stanhope va desenrollar un model provabilístic per a la cantitat de seqüència necessària per a obtindre a lo manco un contig d'un tamany donat de cada organisme nou de la comunitat, mentres que Wendl et al. va informar un anàlisis per al tamany mig del contig o la provabilitat de recuperar completament un organisme nou per a una rarea determinada dins de la comunitat. Pel contrari, Hooper et al. proponen un model semi-empíric basat en la distribució gamma.