Anar al contingut

Gene targeting

De L'Enciclopèdia, la wikipedia en valencià
45px|link=
Este artículo o sección tiene referencias, pero necesita más para complementar su verificabilidad.
Plantilla:Busca fuentes
Este aviso fue puesto el 9 de maig de 2020.
[[Categoria:Wikipedia:Artículos que necesitan referencias adicionales| Plantilla:Problemas artículo/validar]]
Archiu:CAPS 0 Wmice1.jpg
Dos rates knockout

Es definix gene targeting (del anglés, 'apuntar a un gen') com una tècnica que se servix de la recombinació homòloga per a modificar un gen. Esta metodologia, posada a punt pel biòlec ítalo-nortamericà Mario Capecchi (premi Nobel de medicina en 2007, junt als seus colegues Martin Evans i Oliver Smithies[1]), permet cancelar el gen i introduir mutacions.

La selecció de gens pot ser permanent o condicional. Les condicions poden ser un moment específic durant el desenrolle / la vida de l'organisme o la llimitació a un teixit específic, per eixemple.[2] El gene targeting requerix la creació d'un vector específic per a cada gen d'interés. Es tracta en tot cas d'una metodologia molt versàtil, ya que pot utilisar-se para casi qualsevol tipo de gen, independentment de l'expressió del gen.

El gene targeting permet estudiar un gen, analisant en viu qualsevol event biològic que es desenrolla en cas d'absència o mutació del gen mateix. L'aplicació d'esta tècnica ha tingut i contínua tenint un gran èxit en diversos camps de l'investigació biomèdica.

Métodos

[editar | editar còdic]
Archiu:Physcomitrella knockout mutants. CAPS 2
Physcomitrella de tipo salvage i verdets knock-out: Desviació de fenotips induïts en transformantes de biblioteques d'alteració de gens. Es varen cultivar plantes transformades i de tipo salvage de Physcomitrella en mig Knop mínim per a induir la diferenciació i el desenroll de gametóforos. Per a cada planta, es mostra una descripció general (fila superior, la barra d'escala correspon a 1 mm) i un primer pla (fila inferior, la barra d'escala equival a 0,5 mm). A, Planta de verdet de tipo salvage haploide completament coberta en gametóforos frondosos i primer pla d'un full de tipo salvage. B-D, Diferents mutantes.[3]

El método per a la realisació d'un gene targeting varien segons l'organisme utilisat. El gene targeting sobre el Mus musculus (la rata comuna), per eixemple, seguix generalment el següent passage:

  1. realisació a partir de bactèrias d'una construcció d'ADN intermediari que conté típicament partix del gen objectiu, un gen de reporte i un marcador de selecció;
  2. inserció d'esta construcció en l'interior de cèlules estaminales embrionàries de la rata en cultiu;
  3. selecció de les cèlules que presenten una inserció correcta, i la seua injecció en l'interior dels teixits d'un embrió de rata;
  4. naiximent de la rata quimera, en contingut genètic modificat, i selecció dels animals genèticament modificats.

Per a crear un organisme dirigit per un gen, es deu introduir ADN en les seues cèlules. Este ADN deu contindre totes les parts necessàries per a completar la selecció de gens. Com a mínim, esta és la plantilla de reparació d'homologia, que conté l'edició desijada flanquejada per regions de ADN homòlogues (idèntiques en seqüència a) la regió objectiu (estes regions homòlogues es denominen "braços d'homologia"). A sovint, també es requerix un gen reporter i/o un marcador seleccionable (dominant) per a ajudar a identificar i seleccionar les cèlules (o "events") a on realment s'ha produït GT. També és una pràctica comuna aumentar les taxes de GT provocant un trencament de doble cadena (DSB) en la regió de ADN objectiu.[4] Per lo tant, els gens que codifiquen la nucleasa específica de lloc d'interés també poden transformar-se junt en la plantilla de reparació. Estos elements genètics necessaris per a GT poden ensamblarse per mig de clonació molecular convencional en bactèries.

Per a "apuntar" als gens en el verdet, el ADN es incuba junt en protoplastos recent aïllats i en polietilenglicol. Ya que els verdets són organismes haploides,[5] els filaments de verdet (protonema) poden examinar-se directament per a detectar l'objectiu, ya siga per mig del tractament en antibiòtics o en PCR. Únic entre les plantes, este procediment de genètica inversa és tan eficient com en la rent.[6] La selecció de gens s'ha aplicat en èxit en vacuns, ovins, porcins i varis foncs.

Els métodos de "apuntar" a gens s'establixen per a varis organismes modele i poden variar segons l'espècie utilisada. Per a "apuntar" a gens en rates, el ADN s'inserta en cèlules mare embrionàries de rata en cultiu. Les cèlules en l'inserció poden contribuir al teixit d'una rata a través de l'injecció d'embrions. Finalment, es crían rates quiméricos en els que les cèlules modificades formen els òrguens reproductius. Despuix d'este pas, tot el cos de la rata es basa en la cèlula mare embrionària seleccionada.


La freqüència de selecció de gens pot millorar-se significativament per mig de l'us d'endonucleasas dissenyades,[7] com les nucleasas en dits de zinc,[8] endonucleasas dirigides dissenyades, i nucleasas basades en efectors TAL dissenyats.[9] Este método s'ha aplicat a espècies com Drosophila melanogaster,[7] tabac,[10][11] dacsa,[12] cèlules humanes,[13] rates[14] i rates.[14]

Comparació en atres formes d'ingenieria genètica

[editar | editar còdic]
Vore també: CRISPR/Cas
Archiu:Diagrama de Venn que muestra la relación entre diferentes tipos de ingeniería genética.png
Un diagrama de Venn per a mostrar la relació entre tres tipos de 'ingenieria genètica'; Modificació genètica, direccionament de gens i edició del genoma.

La relació entre la selecció de gens, l'edició de gens i la modificació genètica es descriu en el següent diagrama de Venn. Es mostra cóm la "ingenieria genètica" comprén les tres d'estes tècniques. l'edició del genoma es caracterisa per realisar menudes edicions en el genoma en una ubicació específica, a sovint despuix del brot de la regió de ADN objectiu per una nucleasa específica del lloc com CRISPR.[15] La modificació genètica generalment descriu l'inserció d'un transgén (ADN estrany, és dir, un gen d'una atra espècie) en una ubicació aleatòria dins del genoma.[16][17] L'orientació genètica és una ferramenta biotecnológica específica que pot conduir a menuts canvis en el genoma en un lloc específic[4], en el cas del qual les edicions causades per l'orientació genètica contarien com a edició del genoma. No obstant, la selecció de gens també és capaç d'insertar gens complets (com transgenes) en el lloc de destí si el transgén s'incorpora a la plantilla de reparació d'homologia que s'usa durant la selecció de gens.[18][19] En tals casos, les edicions causades per l'orientació genètica es considerarien, en algunes jurisdiccions, com a equivalents a la modificació genètica ya que s'ha produït l'inserció de ADN estrany.[19]


La selecció de gens és una forma específica de ferramenta d'edició del genoma. Atres ferramentes d'edició del genoma inclouen la mutagénesis dirigida, l'edició bàsica i l'edició de calitat, totes les quals creen edicions en el ADN endógeno (ADN ya present en l'organisme) en una ubicació genómica específica.[20][21] Esta naturalea específica de lloc o "dirigida" de l'edició del genoma és típicament lo que fa que l'edició del genoma siga diferent a la "modificació genètica" tradicional que inserta un transgén en una ubicació no específica en el genoma dels organismes, aixina com l'edició de gens fent menudes edicions de el ADN ya present en els organismes, front a l'inserció de modificació genètica de ADN "estrany" d'una atra espècie.[22][23]

Degut a que l'edició de gens produïx canvis més menuts en el ADN endógeno, moltes mutacions creades a través de l'edició del genoma podrien ocórrer en teoria a través de la mutagénesis natural o, en el context de les plantes, a través del mejoramiento per mutació que és part de la reproducció convencional (en contrast, l'inserció d'un transgén en crear un Organisme Genèticament Modificat (OGM) no podria ocórrer naturalment). No obstant, hi ha excepcions a esta regla general; com s'explica en l'introducció, GT pot introduir una varietat de tamanys possibles d'edicions en el ADN; des d'edicions molt menudes, com canviar, insertar o eliminar 1 parell de bases, fins a insertar seqüències de ADN molt més llargues, que en teoria podrien incloure l'inserció d'un transgén complet.[19] No obstant, en la pràctica, GT s'usa més comunament per a insertar seqüències més menudes. La gama d'edicions possibles a través de GT pot dificultar la regulació (vore Regulació).


Les dos formes més establides d'edició de gens són la gene targeting i la mutagénesis dirigida. Mentres que la selecció de gens es basa en la via de reparació de el ADN de reparació dirigida per homologia (HDR) (també cridada recombinació homòloga, HR), la mutagénesis dirigida utilisa l'unió d'extrems no homòlecs (NHEJ, per les seues sigles en anglés) de ADN trencat. NHEJ és una via de reparació de ADN propensa a errors, lo que significa que quan repara el ADN trencat pot insertar o eliminar bases de ADN, creant insercions o eliminacions (indels). L'usuari no pot especificar quins seran estes indeles aleatòries, per lo tant, no pot controlar exactament quines edicions es realisen en el lloc de destí. No obstant, poden controlar on ocorreran estes edicions (és dir, dictar el lloc de destí) per mig de l'us d'una nucleasa específica del lloc (anteriorment nucleasas de dit de zinc i TALEN, ara comunament CRISPR) per a trencar el ADN en el lloc de destí. En la següent figura es mostra un resum de la selecció de gens a través de HDR (també cridada recombinació homòloga) i la mutagénesis dirigida a través de NHEJ.

Archiu:Esquema mostrando los mecanismos de la gene targeting.png
Possibles resultats de la reparació de el ADN despuix del brot per CRISPR, lo que du a l'edició de gens. Abdós cadenes de ADN són tallades per CRISPR-Cas (o una atra nucleasa específica del lloc) per a crear una ruptura de doble cadena (DSB). Després, el DSB es repara a través de dos vies de reparació de ADN alternatives (NHEJ o HR) per a provocar mutacions aleatòries en el lloc de cort ("mutagénesis dirigida") o mutacions específiques si es proporciona una plantilla de reparació que conté eixes edicions específiques ("dirigida a gens").

Les tècniques d'edició de gens desenrollades més recentment d'edició de calitat i edició bàsica,[21] basades en métodos CRISPR-Cas, són alternatives a la selecció de gens, que també poden crear edicions definides per l'usuari en ubicacions genómicas específiques. No obstant, cada u està llimitat en la llongitut d'inserció possible de la seqüència de ADN; l'edició bàsica es llimita a conversió[24] d'un sol parell de bases, mentres que l'edició principal solament pot insertar seqüències de fins a 44 pb.[25][26] Per lo tant, GT seguix sent el método principal d'inserció dirigida (específica de l'ubicació) de seqüències llargues de ADN per a l'ingenieria genómica.


Referències

[editar | editar còdic]
  1. ↑ «Press Release: The 2007 Nobel Prize in Physiology or Medicine». Consultat el 8 d'octubre de 2007.
  2. ↑ Journal of Ophthalmology.2011
    806783.ISSN 2090-0058.doi:10.1155/2011/806783.Consultat el 2026-03-23.
  3. ↑ BMC Plant Biology.2(1)
    6.doi:10.1186/1471-2229-2-6.Consultat el 2023-07-21.
  4. ↑ 4,0 4,1 Journal of Genetic Engineering and Biotechnology.15(2)
    317–321.doi:10.1016/j.jgeb.2017.07.004.Consultat el 2023-07-21.
  5. ↑ Botanica Acta.111(1)
    1–15.doi:10.1111/j.1438-8677.1998.tb00670.x.Consultat el 2023-07-15.
  6. ↑ Trends in Plant Science.3(6)
    209–210.ISSN 1360-1385.doi:10.1016/s1360-1385(98)01257-6.Consultat el 2023-07-15.
  7. ↑ 7,0 7,1 Nucleic Acids Research.37(16)
    5405–5419.ISSN 1362-4962.doi:10.1093/nar/gkp548.Consultat el 2023-07-15.
  8. ↑ Science.300(5620)
    764–764.ISSN 0036-8075.doi:10.1126/science.1079512.Consultat el 2023-07-15.
  9. ↑ Nature Biotechnology.29(2)
    143–148.ISSN 1087-0156.doi:10.1038/nbt.1755.Consultat el 2023-07-15.
  10. ↑ Plant Molecular Biology.69(6)
    699–709.ISSN 0167-4412.doi:10.1007/s11103-008-9449-7.Consultat el 2023-07-15.
  11. ↑ Nature.459(7245)
    442–445.ISSN 0028-0836.doi:10.1038/nature07845.Consultat el 2023-07-15.
  12. ↑ Nature.459(7245)
    437–441.ISSN 0028-0836.doi:10.1038/nature07992.Consultat el 2023-07-15.
  13. ↑ Nature.435(7042)
    646–651.ISSN 1476-4687.doi:10.1038/nature03556.Consultat el 2023-07-15.
  14. ↑ 14,0 14,1 Nature Biotechnology.29(1)
    64–67.ISSN 1087-0156.doi:10.1038/nbt.1731.Consultat el 2023-07-15.
  15. ↑ «Gene Editing – Digital Mija Kit» (en en). National Institutes of Health (NIH). Consultat el 2023-07-21.
  16. ↑ «What llaure GM crops and how is it done? | Royal Society». royalsociety.org. Consultat el 2023-07-21.
  17. ↑ «How does GM differ from conventional plant breeding? | Royal Society». royalsociety.org. Consultat el 2023-07-21.
  18. ↑ The EMBO Journal.7(13)
    4021–4026.doi:10.1002/j.1460-2075.1988.tb03295.x.Consultat el 2023-07-21.
  19. ↑ 19,0 19,1 19,2 «Publication preview page | FAO | Food and Agriculture Organization of the United Nations» (en en). FAODocuments. Consultat el 2023-07-21.
  20. ↑ «Synthego | Full Stack Genome Engineering» (en en). www.synthego.com. Consultat el 2023-07-15.
  21. ↑ 21,0 21,1 Nature Biotechnology.38(7)
    824–844.ISSN 1087-0156.doi:10.1038/s41587-020-0561-9.Consultat el 2023-07-15.
  22. ↑ «What is the Difference Between Genetic Engineering and Gene Editing?» (en en). Science Speaks. Consultat el 2023-07-15.
  23. ↑ «Genetic modification FAQs» (en en). The University of Edinburgh. Consultat el 2023-07-15.
  24. ↑ «CRISPR 101: Cytosine and Adenine Base Editors» (en en-us). blog.addgene.org. Consultat el 2023-07-15.
  25. ↑ «Prime Editing: Adding Precision and Flexibility to CRISPR Editing» (en en-us). blog.addgene.org. Consultat el 2023-07-15.
  26. ↑ Nature.576(7785)
    149–157.ISSN 0028-0836.doi:10.1038/s41586-019-1711-4.Consultat el 2023-07-15.
Obtingut de «https://www.lenciclopedia.org/w/index.php?title=Gene_targeting&oldid=745587»