Seqüenciació per bisulfito
La seqüenciació per bisulfito[1] és el tractament de el ADN en bisulfito previ a una seqüenciació en la finalitat de determinar el patró de metilación de la mostra. La metilación de el ADN va ser la primera marca epigenética descoberta i és la més estudiada. En animals es basa en l'adició d'un grup metilo al carbono 5 dels residus de citosina en els dinucleótidos CpG. Estes marques epigenéticas estan implicades en la repressió de la activitat transcripcional.
El tractament de el ADN en bisulfito convertix els residus d'citosina a uracilo pero no afecta als residus de 5-metilcitosina. Per lo tant, el ADN tractat en bisulfito solament manté les citosina metiladas, mostrant informació sobre l'estat de metilación d'un segment de ADN a nivell de nucleòtit. Per a recopilar esta informació poden realisar-se distints anàlisis sobre la mostra alterada, l'objectiu d'estes proves és localisar polimorfisme puntuals causats per la conversió produïda pel bisulfito.
Métodos
[editar | editar còdic]La seqüenciació per bisulfito aplica rutines de seqüenciació sobre ADN genómico tractat en bisulfito per a determinar l'estat de metilación de la mostra. Atres estratègies que no impliquen seqüenciació poden ser amprades per a determinar la metilación en loci específics o a nivell del genoma sancer. S'assumix que la conversió de les citosina no metiladas a uracilos és completa a lo llarc de la mostra. La metodologia per a analisar ADN tractat en bisulfito es troba en desenroll.[2][3][4][5]
Métodos basats en PCR no específica de metilación
[editar | editar còdic]
Seqüenciació directa
[editar | editar còdic]Es determinen les citosina resistents a la conversió per bisulfito per mig de PCR i una seqüenciació en didesoxinucleótidos.[6] Els cebadores es dissenyen per a ser específics de la mostra i per a que flanquegen els llocs de metilación d'interés. Estos cebadores permetran l'amplificament de seqüències metiladas i no metiladas. En les molècules amplificades, els llocs que hagen sofrit conversió per bisulfito apareixeran com timinas en la cadena sentit i adenina en la antisentido per ser el nucleòtit complementari a uracilo.
Pirosecuenciación
[editar | editar còdic]La pirosecuenciación també ha segut usada per a analisar ADN tractat en bisulfito sense l'us de PCR específica de metilación.[7][8] Despuix de l'amplificament per mig de PCR, la pirosecuenciación és utilisada per a determinar els nucleòtits convertits pel bisulfito. La principal llimitació d'este método és el cost de la tecnologia.
Una millora d'esta tècnica es basa en usar cebadores específics del alel que incorpora polimorfisme puntuals en la seqüència del cebador per a permetre l'anàlisis separat dels dos distints alels paterns.[9] Esta tècnica és especialment útil en anàlisis d'impronta genètica.
Anàlisis de conformació de cadena simple sensible a metilación (MS-SSCA)
[editar | editar còdic]Este método es basa en l'anàlisis de polimorfisme de conformació de cadena simple (SSCA) desenrollat per a detectar mutacions puntuals.[10] SSCA diferència entre cadenes simples de ADN de tamany idèntic pero distinta seqüència basant-se en la migració diferencial en una electroforesis no desnaturalizante. En MS-SSCA, açò és utilisat per a distinguir cadenes de ADN tractades en bisulfito i cadenes sense tractar despuix d'una PCR que amplifique les regions en metilaciones d'interés. No obstant este método carix de la sensibilitat necessària per a detectar diferències en un sol nucleòtit.
Anàlisis d'hibridació d'alta resolució (HRM)
[editar | editar còdic]És una tècnica basada en una PCR quantitativa dissenyada inicialment per a detectar mutacions puntuals.[11] Els amplicones de la PCR són analisats per mig d'un aument de la temperatura i la resultant lliberació d'una tenyida fluorescent durant l'hibridació. El grau de metilación, representat pel contingut d'citosina convertides en timina, determina la velocitat de l'hibridació i de lliberació de la tenyida.
Métodos basats en PCR específica de metilación (MSP)
[editar | editar còdic]Este método alternatiu d'anàlisis de metilación utilisa ADN tractat en bisulfito pero evita la necessitat de secuenciar l'àrea d'interés.[12] Els cebadores són dissenyats per a ser específics de metilación incloent seqüències complementàries solament a citosina metilada o, en el seu lloc, complementaris a la timina resultant de la conversió. La metilación es determina segons l'habilitat del fragment de ADN d'amplificar-se o no. Este método és útil en l'anàlisis d'illes CpG en una possible gran densitat de metilación MPS i métodos relacionats són considerats els més sensibles a l'hora de determinar l'estat de metilación d'un locus específic.
Métodos basats en chips de ADN
[editar | editar còdic]Métodos basats en chips de ADN permeten l'anàlisis del patró de metilación a lo llarc del genoma.[13] Els chips d'oligonucleótidos són dissenyats usant parells de sondes d'hibridació complementàries als llocs de metilación d'interés. Una és complementària a la seqüència inalterada mentres que una atra és complementària a la seqüència tractada en bisulfito. Les sondes són ademés específiques de bisulfito per a evitar l'hibridació en ADN que no ha sofrit conversió completa.
Llimitacions
[editar | editar còdic]5-Hidroximetilcitosina
[editar | editar còdic]La 5-hidroximetilcitosina és una modificació d'este nucleòtit que ha segut descoberta recentment i l'orige del qual és diferent al de la 5-metilcitosina produïda en la metilación de el ADN. Quan és tractat en bisulfito, este nucleòtit es convertix en citosina-5-metilsulfonato, que és interpretat com a citosina durant la seqüenciació.[14] Per lo tant la seqüenciació en bisulfito no pot diferenciar entre 5-metilcitosina i 5-hidroximetilcitosina i l'informació que proporciona este método no pot ser definida únicament com metilación de el ADN.
Conversió incompleta
[editar | editar còdic]La seqüenciació per bisulfito es basa en la conversió completa de tots les citosina no metiladas a uracilo. Si esta conversió és incompleta, l'anàlisis posterior interpretarà les citosina no convertides com a citosina metiladas, resultant en un fals positiu de metilación. Solament les cadenes simples de ADN són susceptibles al bisulfito per lo que la desnaturalización de el ADN mostra és crítica en el procés.[2]
Degradació de el ADN durant tractament en bisulfito
[editar | editar còdic]Les condicions necessàries per a una conversió completa com a llarcs temps d'incubació, temperatures elevades i altes concentracions de bisulfito poden dur a la degradació d'un 90% de el ADN incubado.[15] Ya que la cantitat de ADN inicial és llimitada, la degradació pot ser problemàtica i ocorre per depurinaciones que resulten en trencaments aleatoris de la cadena.[16] Per lo tant, quant més llarc és el producte de PCR desijat, més llimitat serà el número de molècules intactes que quedaran i açò pot dur a un fallo en l'amplificament o a la pèrdua d'informació precisa sobre els nivells de metilación de la mostra.
Referències
[editar | editar còdic]- ↑ Chatterjee A, Stockwell PA, Rodger EJ and Morison IM 2012. Comparison of alignment software for genome-wide bisulphite sequence data. Nucleic Acids Research 40(10): i79.
- ↑ 2,0 2,1 “DNA methylation: a profile of methods and applications” . BioTechniques 33 (3): 632, 634, 636–49. doi:. PMID 12238773.
- ↑ (2003) «Methods: DNA methylation», Peroxisomal Disorders and Regulation of Gens (vol. 544), pp. 197–204. doi:10.1007/978-1-4419-9072-3_23. ISBN 978-0-306-48174-1.
- ↑ “The power and the promise of DNA methylation markers” . Nature Reviews. Cancer 3 (4): 253–66. doi:. PMID 12671664.
- ↑ “The emerging science of epigenomics” . Human Molecular Genetics 15 Spec No 1 (90001): R95-101. doi:. PMID 16651376.
- ↑ “A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands” . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89 (5): 1827–31. doi:. PMID 1542678. Bibcode: 1992PNAS...89.1827F.
- ↑ “Sensitive and quantitative universal Pyrosequencing methylation analysis of CpG sites” . BioTechniques 35 (1): 146–50. doi:. PMID 12866414.
- ↑ “Analysis and quantification of multiple methylation variable positions in CpG islands by Pyrosequencing” . BioTechniques 35 (1): 152–6. doi:. PMID 12866415.
- ↑ “Rapid and quantitative method of allele-specific DNA methylation analysis” . BioTechniques 41 (6): 734–9. doi:. PMID 17191619.
- ↑ “Methylation-sensitive, single-strand conformation analysis (MS-SSCA): A rapid method to screen for and analyze methylation” (1999). Human Mutation 14 (4): 289–93. doi:. PMID 10502775.
- ↑ “Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation” (2007). Nucleic Acids Research 35 (6): i41. doi:. PMID 17289753.
- ↑ “Methylation-specific PCR: a novell PCR assay for methylation status of CpG islands” . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93 (18): 9821–6. doi:. PMID 8790415. Bibcode: 1996PNAS...93.9821H.
- ↑ “Tumour class prediction and discovery by microarray-based DNA methylation analysis” . Nucleic Acids Research 30 (5): 21i–21. doi:. PMID 11861926.
- ↑ Huang I, Pastor WA, Shen I, Tahiliani M, Liu DR, Rao A. The Behaviour of 5-Hydroxymethylcytosine in Bisulfite Sequencing. PLOS ONE.2010;5(1):i8888.
- ↑ “Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters” . Nucleic Acids Research 29 (13): E65-5. doi:. PMID 11433041.
- ↑ “A new method for accurate assessment of DNA quality after bisulfite treatment” (2007). Nucleic Acids Research 35 (5): i29. doi:. PMID 17259213.
- Este artícul conté una traducció derivada de «Secuenciación por bisulfito» de Wikipedia en castellà publicada baix la Llicència de documentació lliure de GNU i la Llicència Creative Commons Reconeiximent-CompartirIgual 4.0 Internacional.