Pirosecuenciación

La pirosecuenciación és una tecnologia que permet determinar l'orde d'una seqüència de ADN per mig de lluminiscència. Es basa en el principi de "seqüenciació per síntesis" en el que es detecta l'incorporació de nucleòtits a el ADN per acció de la ADN polimerasa. La particularitat d'este método és que detecta la lliberació de pirofosfato quan els nucleòtits són incorporats. A partir del pirofosfato es generarà llum per mig de diverses reaccions enzimàtiques en cadena.

Fonaments - Lluminiscència

How Pyrosequencing Works

Funcionament de la pirosecuenciación.

El ADN es desnaturaliza per a obtindre ADN monocatenario i es hibridará en un cebador. En el tubo de reacció es trobaran les enzimes luciferasa, ATP sulfurilasa, ADN polimerasa i apirasa ademés dels substrats luciferina i adenosín-5-fosfosulfato (APS).

A continuació s'afigen els nucleòtits un despuix de l'atre, al contrari que en una reacció de seqüenciació normal a on s'afigen tots al mateix temps.

1. Si el nucleòtit afegit al mig de reacció correspon al que necessita la polimerasa, s'incorpora a la cadena que s'està sintetisant (elongamiento) i es llibera un pirofosfato.
2. Posteriorment, una ATP sulfurilasa en presència de el APS transforma este pirofosfato (PPi) en ATP , que s'acoplarà a la luciferina, formant un complex el qual serà utilisat per una luciferasa.
3. Com a resultat es produïx oxiluciferina i una senyal lluminosa d'intensitat proporcional al número de nucleòtits incorporats. És el seqüenciador o més precisament el sensor CCD, el que captura esta senyal lumínica i ho reproduïx com un pico en un pirograma.

Finalment, una apirasa s'encarrega de degradar aquells nucleòtits que no han segut incorporats i queden solts en la finalitat de que en afegir un nou dNTP, no existixquen restants de reaccions anteriors.

D'esta forma es pot deduir la seqüència partint del tamany dels picos obtinguts. Si hi ha un polimorfisme en una seqüència no hi hauria problemes per a detectar-ho puix el tamany dels picos també és proporcional a les cadenes portadores d'un nucleòtit o un atre.

La pirosecuenciación hui en dia és utilisada principalment per a seqüències de tamany reduït, puix per a proyectes de major tamany ha segut principalment substituïda per NGS (Next-Generation Sequencing), és una tècnica en una relació de cost-efectivitat favorable, ya que a chicoteta escala és més ràpida i econòmica que els métodos pertanyents a NGS.

Seqüenciació 454

És una variant de la pirosecuenciación descrita per Jonathan Rothberg i colaboradors de l'empresa 454 Life Sciences en 2005. Esta tècnica permet secuenciar de forma paralela i massiva molts fragments de ADN al mateix temps. D'esta manera la seqüenciació 454 es va convertir en la primera tecnologia de la next-generation sequencing suponent una gran reducció en els preus de la seqüenciació de genomes complets. En 2013 la plataforma de seqüenciació 454 va deixar de ser competitiva i la companyia Roche, que havia adquirit 454 Life Science en 2007, va decidir deixar de comercialisar-la.

Procediment:

1. Fragmentar el ADN de doble cadena a secuenciar per mig d'un procés conegut com nebulización para aixina poder marcar els extrems en dos primers. Un d'ells es va adherir a les microesferas i l'atre s'usarà per a començar l'amplificament. Finalment, se separen els fragments de el ADN de doble cadena en la seua forma monocatenaria.
2. Per mig d'una emulsió d'oli es generen microesferas, on s'unirà un únic fragment de ADN monocatenario. Després s'afig una emulsió que conté els microrreactores. En cada microrreactor es troben els elements necessaris per a la reacció de PCR: oligonucleótidos, dNTPs, polimerasa i un únic fragment de ADN mòle, açò és important, puix si s'unira més d'un fragment a cada microrreactor disminuiria l'exactitut i la capacitat d'interpretació de la senyal de seqüenciació. Per a facilitar açò s'afig una major cantitat de microesferas que de ADN.
3. Per mig de l'amplificament per PCR, es generen moltes còpies del mateix fragment de ADN original i els fragments amplificats resultants seguiran immovilisats en les microesferas.
4. Despuix es lliberen els contes de l'emulsió i es coloquen en plaques a on ocorrerà la seqüenciació. Primer s'aboca l'emulsió sobre una fase sòlida en celdillas en el qual solament cap una microesfera. Després afegim les enzimes sulfurilasa i luciferasa.
5. En cada una d'estes celes es produïx una pirosecuenciación. La seqüenciació completa es porta a terme afegint un dels quatre nucleòtits i observant qué celdilla s'allumena. Despuix de cada adició de nucleòtits es llava i s'afig el següent nucleòtit. Este procés es repetix fins a completar la seqüència.
6. Els resultats es compararan en un genoma de referència.