Seqüenciació del exoma

Fluix de treball de la seqüenciació de exoma: partix 1.

La seqüenciació del exoma, també coneguda com a seqüenciació del exoma complet (WES), és una tècnica genómica utilisada per a secuenciar totes les regions dels gens que codifiquen per a proteïnes en un genoma (conegut com exoma). Esta tècnica consta de dos passos clarament diferenciats: el primer pas és seleccionar solament l'ADN que codifica para proteïnes. Estes regions es coneixen com exones - els humans tenim al voltant de 180.000 exones, que constituïxen casi un 1% del genoma humà, aproximadament 30 millons de pares de bases. El segon pas és secuenciar este ADN utilisant qualsevol tècnica de seqüenciació d'alt rendiment.

Utilisant este enfocament es pretén identificar aquelles variants genètiques que alteren les seqüències de proteïnes, i fer-ho a un cost molt menor que una seqüenciació de genoma complet. ya que estes variants poden ser responsables tant de Malalties Mendelianas com de Malalties poligèniques comunes, com pot ser l'Alzheimer, la seqüenciació de exoma complet s'està aplicant no solament en investigació acadèmica, sino també diagnòstic clínic.

Fluix de treball de la seqüenciació de exoma: partix 2

Detecció de mutacions en càncer

Una de les moltes utilitats que té actualment la seqüenciació del exoma complet és utilisar-la com a base per a detectar variacions de nucleòtit únic o "SNV" (Single Nucleotide Variant), que d'alguna manera estiguen relacionades en l'aparició d'un tumor. Ademés, en ser un anàlisis del exoma, estes variacions es reduïxen solament a gens que codifiquen per a proteïnes, per lo que la seua detecció aporta informació de gran interés, no només al camp d'investigació del càncer sino també a l'investigació de proteïnes i de biologia molecular.

El major problema que presenten este tipo d'estudis és la seua baixa reproducibilidad (11-49%), junt en una falta de consens sobre quins són els protocols òptims durant les distintes etapes del processament de la mostra, des de la seua obtenció i almagasenage, fins a les distintes ferramentes bioinformáticas utilisades per a analisar les senyes. Tractant de solucionar alguns d'estos problemes, es va realisar un macro estudi en el que es varen comparar senyes de WGS i de WES de distints tipos de mostres de la mateixa llínea celular tumoral, de huit centres distints utilisant protocols, cantitats d'entrada de ADN i seqüenciadors diferents. Les recomanacions obtingudes del treball varen ser les següents:

Cantitat de ADN d'entrada i construcció de llibreria: el tamany de fragment ideal estaria entre 250-350 pares de bases (pb), el método de fragmentació sonicación per a fragments de més de 250pb i enzimàtic per a fragments menors de 200pb. Sobre la cantitat de ADN depén de la llibreria triada, 200-1000ng per a TruSeq PCR-free, 10-200ng per a TruSeq-Nano o 1-100ng per a Nextera Flex.

Cobertura de llectura i segur de calitat: si el percentage de contingut en cèlules tumorals de la mostra és major al 50%, es recomana cobertura x100, pero si el contingut és menor a 50%, es recomana una cobertura x200. Ademés per a assegurar una bona calitat dels resultats es recomana que les llectures redundantes siguen menors a un 30%, que les mapeables siguen superiors a un 95%, que el contingut en GC estiga entre 45-48% i un GIV menor a 1,5.

Programes de alineamiento: es varen utilisar tres Bowtie2, BWA-MEM i NovoAlign pero no es varen trobar diferències significatives per a WES.

Detector de mutacions: dels tres utilisats (MuTect2, SomaticSniper i Strelka2) el que va obtindre millors resultats en molta diferència va ser MuTect2.

Ademés, com a observacions finals en este treball es va concloure que la detecció de mutacions en cancer és un procés inherentemente integrat del com cada component i cada combinació d'estos és igual d'important i, finalment, que els estudis de revisió i validació deuen realisar-se tenint en conte tot el procés, des de la mostra fins al resultat.