Seqüenciació d'escopeta
En genètica, la seqüenciació d'escopeta o shotgun sequencing és un método utilisat para secuenciar cadenes de ADN aleatòries. Rep el seu nom per analogia en el patró de dispar cuasialeatorio de ràpida expansió d'una escopeta.
El método de seqüenciació de ADN per terminació de cadena ("seqüenciació de Sanger") solament es pot utilisar per a cadenes curtes de ADN de 100 a 1000 pares de bases. Per este llímit de tamany, les seqüències més llargues es subdividen en fragments més menuts que es poden secuenciar per separat, i estes seqüències es ensamblan per a donar la seqüència general.
Hi ha dos métodos principals per a este procés de fragmentació i seqüenciació. Primer walking (o "chromosome walking") progressa a través de tot el bri peça per peça, mentres que la seqüenciació ràpida és un procés més ràpit, pero més complex que utilisa fragments aleatoris.
En la seqüenciació d'escopeta,[1][2] ADN es dividix a l'encert en numerosos segments menuts, que es secuencian utilisant el método de terminació de cadena per a obtindre llectures. S'obtenen múltiples llectures superpostes per a el ADN diana realisant vàries rondes d'esta fragmentació i seqüenciació. Els programes de computadora després usen els extrems superposts de diferents llectures per a ensamblarlos en una seqüència contínua.
La seqüenciació per escopeta va ser una de les tecnologies precursores que va ser responsable de permetre la seqüenciació completa del genoma.
Eixemple
[editar | editar còdic]Per eixemple, considere les següents dos rondes de llectures d'escopeta:
| Bri | Seqüència |
|---|---|
| Original | AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA
|
| Primera seqüència d'escopeta | AGCATGCTGCAGTCATGCT--------------------------TAGGCTA
|
| Segona seqüència d'escopeta | AGCATG--------------------------CTGCAGTCATGCTTAGGCTA
|
| Reconstrucció | AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA
|
En este eixemple extremadament simplificat, cap de les llectures cobrix la llongitut completa de la seqüència original, pero les quatre llectures es poden ensamblar en la seqüència original usant la superposició dels seus extrems per a alinear-les i ordenar-les. En realitat, este procés utilisa enormes cantitats d'informació plagada d'ambigüitats i errors de seqüenciació. L'ensamblage de genomes complexos també es complica per la gran abundància de seqüències repetitives, lo que significa que llectures curtes similars podrien provindre de parts completament diferents de la seqüència.
Es necessiten moltes llectures superpostes per a cada segment de el ADN original per a superar estes dificultats i ensamblar en precisió la seqüència. Per eixemple, per a completar el Proyecte Genoma Humà, la major part del genoma humà es secuenció a una cobertura 12X o major; és dir, cada base de la seqüència final va estar present en promig en 12 llectures diferents. Aixina i tot, els métodos actuals no han conseguit aïllar o ensamblar una seqüència confiable per a aproximadament el 1% del genoma humà (eucromático), fins a 2004.[3]
Seqüenciació escopeta del genoma complet
[editar | editar còdic]Història
[editar | editar còdic]La seqüenciació ràpida del genoma complet per a genomes menuts (4000 a 7000 parells de bases) es va sugerir per primera volta en 1979.[1] El primer genoma secuenciado per seqüenciació d'escopeta va ser el del virus del mosaic de la coliflor, publicat en 1981.[4][5]
Seqüenciació paired-end
[editar | editar còdic]L'aplicació més àmplia es va beneficiar de la seqüenciació d'extrems per parells, coneguda coloquialmente com a seqüenciació d'escopeta de doble canó (double-barrel shotgun sequencing). A mida que els proyectes de seqüenciació varen començar a assumir seqüències de ADN més llargues i complicades, varis grups varen començar a donar-se conte de que es podia obtindre informació útil secuenciando abdós extrems d'un fragment de ADN. Encara que secuenciar abdós extrems del mateix fragment i realisar un seguiment de les senyes emparellades va ser més engorroso que secuenciar un sol extrem de dos fragments distints, saber que les dos seqüències estaven orientades en direccions opostes i tenien aproximadament la llongitut d'un fragment aparte de cada u va ser valiós per a reconstruir la seqüència del fragment objectiu original.
Història. La primera descripció publicada de l'us d'extrems emparellats va ser en 1990[6] com a part de la seqüenciació del locus HGPRT humà, encara que l'us d'extrems emparellats es va llimitar a tancar breches despuix de l'aplicació d'un enfocament de seqüenciació d'escopeta tradicional. La primera descripció teòrica d'una estratègia de seqüenciació d'extrems per parells pura, assumint fragments de llongitut constant, va anar en 1991.[7] En eixe moment, existia un consens de la comunitat de que la llongitut òptima del fragment per a la seqüenciació final per parells seria tres voltes la llongitut de llectura de la seqüència. En 1995, Roach et al.[8] va introduir l'innovació d'usar fragments de diferents tamanys i va demostrar que una estratègia pura de seqüenciació final per parells seria possible en grans objectius. L'estratègia va ser posteriorment adoptada pel Institut d'Investigació Genómica (TIGR) para secuenciar el genoma de la bactèria Haemophilus influenzae en 1995,[9] i després per Celera Genomics para secuenciar el genoma de Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) en 2000,[10] i posteriorment el genoma humà.
Acostament
[editar | editar còdic]Per a aplicar l'estratègia, un bri de ADN d'alt pes molecular es talla en fragments aleatoris, se selecciona per tamany (generalment 2, 10, 50 i 150 kb) i es clona en un vector apropiat. A continuació, els clons es secuencian des d'abdós extrems usant el método de terminació de cadena produint dos seqüències curtes. Cada seqüència es denomina llectura final o llectura 1 i llectura 2 i dos llectures del mateix clon es denominen parells de apareamiento. Ya que el método de terminació de la cadena generalment solament pot produir llectures d'entre 500 i 1000 bases de llarc, en tots els clons, llevat en els més menuts, els parells de apareamiento rara volta se superponen.
Montage
[editar | editar còdic]La seqüència original es reconstruïx a partir de les llectures utilisant un software d'ensamblage de seqüències. Primer, les llectures superpostes es recopilen en seqüències compostes més llargues conegudes com contigs. Els contigs es poden unir en bastides seguint les conexions entre parells de aparejos. La distància entre els contigs es pot inferir de les posicions dels parells coincidentes si es coneix la llongitut promig del fragment de la biblioteca i té una finestra de desviació estreta. Depenent del tamany de l'espai entre contigs, es poden usar diferents tècniques per a trobar la seqüència en els espais. Si l'espai és menut (5-20 kb), llavors es requerix l'us de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) per a amplificar la regió, seguida de la seqüenciació. Si la brecha és gran (>20 kb), el fragment gran es clona en vectores especials com els cromosomes artificials bacterians (BAC) seguit de la seqüenciació del vector.
Pros i contres
[editar | editar còdic]Els defensors d'este enfocament argumenten que és possible secuenciar tot el genoma al mateix temps utilisant grans conjunts de seqüenciadors, lo que fa que tot el procés siga molt més eficient que els enfocaments més tradicionals. Els detractors argumenten que, encara que la tècnica seqüència ràpidament grans regions de ADN, la seua capacitat per a unir correctament estes regions és sospitosa, particularment per a genomes en regions repetides. A mida que els programes d'ensamblage de seqüències es tornen més sofisticats i la potència informàtica es torna més barata, pot ser possible superar esta llimitació.
Cobertura
[editar | editar còdic]La cobertura (profunditat o profunditat de llectura) és el número mig de llectures que representen un nucleòtit donat en la seqüència reconstruïda. Es pot calcular a partir de la llongitut del genoma original (G), el número de llectures (N) i la llongitut mija de llectura (L) com ___MATH_0___. Per eixemple, un genoma hipotètic en 2.000 parells de bases reconstruïts a partir de 8 llectures en una llongitut promig de 500 nucleòtits tindrà una redundància 2x. Este paràmetro també permet estimar atres cantitats, com el percentage del genoma cobert per llectures (a voltes també cridat cobertura). Es desija una alta cobertura en la seqüenciació d'escopeta perque pot superar errors en la anomenada i l'ensamblage de bases. El tema de la teoria de la seqüenciació de el ADN aborda les relacions de tals cantitats.
A voltes es fa una distinció entre cobertura de seqüència i cobertura física. La cobertura de seqüència és el número promig de voltes que es llig una base. La cobertura física és el número mig de voltes que es llig o s'amplia una base per mig de llectures emparellades.[11]
Referències
[editar | editar còdic]- ↑ 1,0 1,1 Nucleic Acids Research.6(70)
- 2601–10.doi:10.1093/nar/6.7.2601.
- ↑ Nucleic Acids Research.9(13)
- 3015–3027.ISSN 0305-1048.doi:10.1093/nar/9.13.3015.
- ↑ Nature.431(7011)
- 931–945.ISSN 1476-4687.doi:10.1038/nature03001.
- ↑ Nucleic Acids Research.9(12)
- 2871–2888.ISSN 0305-1048.
- ↑ Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.113(29)
- 7935–7937.ISSN 0027-8424.doi:10.1073/pnas.1608857113.
- ↑ Methods.3(1)
- 41–47.ISSN 1046-2023.doi:10.1016/S1046-2023(05)80162-8.
- ↑ Genomics.6(4)
- 593–608.ISSN 0888-7543.doi:10.1016/0888-7543(90)90493-i.
- ↑ Genomics.26(2)
- 345–353.ISSN 0888-7543.doi:10.1016/0888-7543(95)80219-c.
- ↑ Science (New York, N.Y.).269(5223)
- 496–512.ISSN 0036-8075.doi:10.1126/science.7542800.
- ↑ Science (New York, N.Y.).287(5461)
- 2185–2195.ISSN 0036-8075.doi:10.1126/science.287.5461.2185.
- ↑ Nature Reviews. Genetics.11(10)
- 685–696.ISSN 1471-0064.doi:10.1038/nrg2841.
- Este artícul conté una traducció derivada de «Secuenciación de escopeta» de Wikipedia en castellà publicada baix la Llicència de documentació lliure de GNU i la Llicència Creative Commons Reconeiximent-CompartirIgual 4.0 Internacional.