Método de Bradford
El método de Bradford és una tècnica colorimètrica utilisada per a la quantificació de proteïnes. El reactiu utilisat per a este procés habitualment li'l denomina com "Reactiu de Bradford" que es prepara utilisant com a colorant el Coomassie Brilliant Blue G-250. El método es basa en el canvi diferencial del color d'este colorant en resposta a distintes concentracions de proteïnes i va ser publicat en 1976 per Marion M. Bradford[1]
Principi
[editar | editar còdic]
El método de Bradford es basa en la variació d'absorbancia produïda pel canvi de color del Coomassie Brilliant Blue G-250. D'acort a l'estructura de la molècula d'este colorant s'observa que posseïx dos grups d'amina terciarias en la càrrega en resonància, susceptibles de protonarse. La forma catiónica del colorant és roja, correspon a la forma doble protonada i el seu màxim en l'espectre d'absorció es troba a una llongitut d'ona entre 465 i 470 nm, la forma neutra és verda, correspon a la forma simple protonada i té el seu pico d'absorció a 650 nm. En canvi, la forma aniónica, correspon a la forma desprotonada, la seua càrrega es deu al grup sulfónico, és blau i l'absorció màxima correspon a una llongitut d'ona d'aproximadament 595 nm. Les tres formes (catiónica - neutra - aniónica) es troben en equilibri.
El Coomassie Brilliant Blue G-250 interacciona principalment en els residus d'aminoàcits bàsics (histidina, arginina i lisina) encara que els aminoàcits aromàtics (triptofano, tirosina i fenilalanina) contribuïxen en alguna mida a l'unió colorant-proteïna.[2] La variació d'absorbancia del blau de Commassie és proporcional a la cantitat de colorant unit a proteïnes, per lo que és també proporcional a la concentració de proteïnes en una solució.
El principi del Método de Bradford és per fixació de la proteïna al colorant (no es genera un enllaç covalente en la reacció). Per a alcançar la màxima sensibilitat en la variació de la llongitut d'ona, el colorant deu estar preparat (vore més alvance) de manera que es trobe majoritàriament en la forma doblement protonada (roig). En agregar la solució proteica, els grups sulfónicos ionizados interactuen electrostáticamente en els residus carregats positivament de les proteïnes. Açò modifica l'estructura de la proteïnes, revelant grups hidrofòbics que contribuïxen en alguna mida a la fixació en el colorant.[2] L'unió en la proteïna consumix la forma aniónica de molècules del colorant desplaçant l'equilibri i produint el consegüent virage cap al color blau.
Preparació de el "Reactiu de Bradford"
[editar | editar còdic]Els materials són: Coomassie Brilliant Blue G-250; Etanol 95% v/v; Àcit fosfórico 85% v/v; Aigua destilada.[1] La preparació consistix en pesar 100 mg de Coomassie Brilliant Blue G-250 i dissoldre en 50 ml d'Etanol 95%. Agregar 100 ml de l'Àcit fosfórico 85% i dur a un volum final d'1 litro en l'Aigua destilada. Les concentracions finals resultants seran: 0,01% m/v Coomassie Brilliant Blue G-250, 4,7% m/v Etanol i 8,5% m/v Àcit fosfórico.
També existixen preparacions comercials d'este reactiu.
Referències
[editar | editar còdic]- Este artícul conté una traducció derivada de «Método de Bradford» de Wikipedia en castellà publicada baix la Llicència de documentació lliure de GNU i la Llicència Creative Commons Reconeiximent-CompartirIgual 4.0 Internacional.