Hibridació fluorescent in situ

FISH metafásico en humans. En groc, el cromosoma 2.

FISH o hibridació fluorescent in situ és una tècnica citogenética de marcage de cromosomes per mig de la qual estos són hibridados en sondes que emeten fluorescència i permeten la visualisació, distinció i estudi dels cromosomes de núcleus en metafase o inferfase, aixina com de les anomalies que puguen presentar. Dita tècnica va ser desenrollada per un equip biomèdic a principis de la década de 1980. Esta tècnica permet la ràpida determinació d'aneuploidías, microdeleciones, duplicació, inversions, aixina com l'adjudicació d'un marcador genètic a un cromosoma (cartografia genètica). Es realisa una tinción de DNA no específica en DAPI i es vorà la fluorescència baix el microscopi.

Els cromosomes que són usualment analisats per FISH són els 13, 18, 21, X i I, que són els més propensos a sofrir anomalies. Estan relacionats en malalties com el síndrome de Patau (13), el síndrome d'Edwards (18), el síndrome de Down (21), el síndrome de Turner (X) i el síndrome de l'superhombre (I), entre uns atres. No obstant, com són possibles marcats adicionals del cromosoma, atres cromosomes poden ser visualisats en esta tècnica. FISH usa segments d'un únic bri d'ADN que són tintats, o etiquetages, en una substància fluorescent que pot lligar-se a un cromosoma específic; estos segments de ADN són cridats sondes. En un principi s'ampraven sondes de caràcter radiactiu, pero este tipo de marcage va ser reemplaçat pels fluoróforos per major seguritat, eficàcia i facilitat de detecció.

Archiu:MouseChromosomeTerritoriesBMCCell Biol6-44Fig2.jpg

FISH interfásico en rata.

Protocol bàsic

El primer pas de la tècnica consistix en la desnaturalización de el DNA per a separar la doble hèliç. A la mostra desnaturalizada se li afig llavors la sonda d'interés (fragment de ADN marcat fluorescentemente). Primer, les sondes hibridan a les regions específiques per a les que han segut dissenyades. Despuix, s'teñir els núcleus en un color de contrast inespecífico (generalment DAPI). Les sondes de DNA poden marcar-se en molècules fluorescents denominats fluoróforos (método directe) o no fluorescents que es detecten en anticossos fluorescents (método indirecte). Per últim, es visualisa la mostra preparada baix un microscopi de fluorescència.

FISH en metafase

Quan les cèlules estan en metafase, els seus cromosomes es troben condensados a modo de preparació per a la divisió celular. Per a detindre-les en metafase, s'ampra colchicina, un agent despolimerisant dels microtúbuls encarregat de separar les cromátidas germanes d'un cromosoma, impedint aixina l'alvanç de la divisió celular. Este tipo de FISH s'utilisa per a detectar microdeleciones específiques, translocación o per a identificar material extra d'orige desconegut. Els tipos de sondes usades són:

• Els cósmidos són seqüències úniques que hibridan en fragments menuts. S'ampren en estudis de microdeleciones.
• Les sondes satèlits estan formades per seqüències altament repetides que es troben prop de lo centrómeros. En la majoria dels casos són específiques de cada cromosoma. S'usen per a determinar aneuploidias o per a identificar l'orige de cromosomes marcadors.

• Les sondes completes consistixen en la suma de vàries sondes que hibridan en distintes zones del cromosoma i aixina marcar el cromosoma complet. S'usen per a vore translocación.

En l'image que acompanya el text es mostra un eixemple d'us d'una sonda completa per al cromosoma 4, en el que destaquen les dos còpies de dit cromosoma sobre el restant.