Enterobacteria phage M13
El fago M13 és un bacteriòfec filamentoso compost per una única molècula d'ADN monocatenario circular la qual té aproximadament 6407 nucleòtits de llongitut; esta molècula es troba encapsulada en una coberta proteica formada per aproximadament 2700 còpies de la proteïna major de recobriment P8, i encapuchada en els extrems per cinc còpies de dos diferents proteïnes de recobriment menors (P9, P6, P3). La proteïna de recobriment menor P3 permet que el fago s'una a un receptor present en la punta dels pilli del hospedador Escherichia coli. L'infecció en bacteriòfecs filamentosos no és letal per a les bactèries; no obstant l'infecció causa plaques térboles en els cultius de I. coli. Encara que no es tracta d'un virus lítico, si s'ha observat una disminució en la velocitat de reproducció de les cèlules infectades. Els plásmidos M13 cridats fagémidos són utilisats en numerosos processos de recombinació d'ADN, i el virus ha segut estudiat per les possibles aplicacions en nanoestructuras i nanotecnología dels principis que dominen el seu procés de encapsulamiento.
Estructura del fago
[editar | editar còdic]La coberta proteica del fago es troba formada primàriament per un ensamble de monòmers d'una proteïna formada per 50 aminoàcits anomenada pVIII (o p8), la qual es troba codificada pel gen VIII (o g8) en el genoma del fago. Un fago M13 de tipo selvat ampra aproximadament unes 2700 còpies de la proteïna p8 per a formar la coberta que, típicament, té aproximadament 900 nm de llongitut. No obstant, les dimensions de la coberta són flexibles i el número de monòmers de p8 utilisats per a formar-la es poden ajustar per a empacar correctament el tamany del genoma de cadena simple que ho forma. Per eixemple, quan el genoma del fago es muta per a reduir el número de bases d'ADN (de 6,4 kb a 221 pb),[1] el número de còpies de p8 utilisades per a empacarlo es reduïx a menys de 100, provocant que la coberta de p8 s'ajuste per a acomodar el genoma reduït. Aparentment existix una llimitació en la capacitat del fago per a contindre material genètic que està entorn al doble del seu contingut normal d'ADN. No obstant, la deleción del gen que codifica per a la proteïna p3 del fago prevé que este puga escapar del seu hospedador I. coli, i en estes condicions és possible trobar dins de la cèlula hospedadora fagos en una llongitut d'entre 10 i 20 voltes la llongitut normal, partícules víriques que posseïxen vàries copes del genoma del fago.
Existixen també atres quatre proteïnes en la superfície del fago, dos de les quals han segut extensament estudiades. En un dels extrems del filament hi ha cinc còpies de la proteïna de superfície pIX (p9) i de la seua proteïna acompanyant pVII (p7) que es troba més profundament enclavada en la coberta proteica del fago. Si fora possible comparar a la proteïna p8 en el material del com està formada el asta del bastó que és el fago, llavors p7 i p9 formen el pomo que és possible vore en les microfotografías. Estes proteïnes són molt menudes, contenint 33 i 32 aminoàcits respectivament, no obstant és possible afegir residus a la porció terminal de cada una, ya que esta porció es troba #present en la part exterior de la coberta. En l'atre extrem del fago hi ha cinc còpies de la proteïna pIII (p3) expostes en la superfície i de la proteïna accessòria pVI (p6) la qual es troba una miqueta menys exposta. Estes formen l'extrem redonejat del fago i són les primeres proteïnes en interaccionar en el hospedador I. coli en el moment de l'infecció. La proteïna p3, és ademés l'últim punt de contacte en el hospedador quan la partícula viral abandona la superfície bacteriana.
Cicle vital del fago
[editar | editar còdic]Les etapes generals del cicle de vida viral són: infecció, replicació del genoma viral, ensamble de noves partícules virals, i lliberació de la progenie de partícules del microorganisme hospedador.
Infecció
[editar | editar còdic]Els fagos filamentosos utilisen una estructura bacteriana coneguda com pilus F per a infectar a I. coli. La proteïna p3 de l'extrem del fago s'ancora a la proteïna To1A de el pilus bacterià permetent-li al fago transferir el seu genoma cap a la citoplasma de la bactèria, a on les enzimes de la maquinària metabòlica bacteriana convertixen el genoma format per una cadena simple d'ADN (cridada cadena positiva o +), en la forma replicativa (FR) d'ADN doble cadena. Esta forma replicativa servix ademés de mòle per a l'expressió dels gens virals.
Replicació del genoma
[editar | editar còdic]L'ADN de fago que entra en la cèlula és de cadena senzilla i li'l sol cridar "#bri +". A penes penetra en la cèlula, l'ARN polimerasa de la cèlula hospedadora sintetisa un cebador en l'orige de replicació. l'ADN polimerasa de la cèlula hospedadora escomença a sintetisar la cadena complementària que es denomina "#bri -". Quan la Pol III troba el cebador es disocia de l'ADN. Després l'ADN Pol I en activitat exonucleasa 5'elimina el cebador i ompli la brecha. Finalment la ligasa suelda els dos trams d'ADN recent sintetisats. La #síntesis de la cadena - dona lloc a un ADN de doble cadena cridat "forma replicativa".
Dos productes dels gens del virus complixen un rol crític en esta etapa del cicle de vida del fago: Estos són la proteïna pII (p2) que és una endonucleasa i provoca una "muesca" en el genoma viral quan es troba en la seua forma de doble cadena, per a possibilitar l'iniciació en la replicació de la cadena + i permaneix unida al fosfat en l'extrem 5' deixant l'extrem 3' lliure. Sense la presència de p2, no es pot produir la replicació del fago. Les enzimes de la bactèria hospedadora van completant les cadenes + en la seua cadena complementària formant d'esta manera múltiples còpies de l'ADN viral en la seua forma de doble cadena. La proteïna pV (p5) competix en la formació d'ADN de doble cadena seqüestrant còpies senzilles de la cadena + formant un complex nucleoproteico que servirà de núcleu per a la formació de noves partícules virals.
La proteïna Rep de l'hoste és una helicasa que ajuda a desenredar l'ADN en el punt a on es troba la muesca. L'ADN Pol III de l'amfitrió utilisa extrem 3' lliure com un cebador per a la #síntesis d'un nou #bri +, mentres que la vella es lleva. Una volta completada la replicació s'obtenen dos molècules d'ADN: una circular de doble cadena i una de cadena senzilla, sobre esta última actua la proteïna p2 soldando l'extrem 5 'i 3' per mig d'una reacció de transesterificación recreant d'esta forma un #bri +. Este procés continua fins que s'escomença a acumular p5. Esta proteïna s'unix a l'ADN de cadena senzilla + i evita que se seguixca replicant.
Existix ademés una proteïna adicional codificada pel genoma del fago, la pX (p10), que és important per a regular el número de genomes de doble cadena en el hospedador bacterià. Sense la proteïna p10 no s'acumulen cadenes +. Lo que resulta particularment interessant sobre esta proteïna és que és idèntica a la porció carboxilo terminal de p2, ya que el gen que codifica per a p10 es troba de fet dins del gen p2 i la proteïna sorgix d'una iniciació diferencial de la transcripció dins del gen de p2. Açò fa que la manipulació de p10 es trobe inextricablemente unida a la manipulació de p2 (un verdader mal de cap des del punt de vista de l'ingenieria) pero açò conseguix una estructura genètica sumament compacta i eficient en la naturalea.
Ensamblage de les partícules virals
[editar | editar còdic]La maduració del fago requerix de les proteïnes pIV (p4), pI (p1) codificades també en el genoma viral, i de la proteïna pXI (p11). Esta última és una proteïna codificada pel mateix gen pI, i és producte d'un punt d'iniciació de transcripció diferencial. En la membrana externa de la bactèria es ensamblan múltiples còpies (generalment entre 12 i 14) de p4 per a formar una estructura estable en forma de barril. En forma similar un grapat de p1 i p11 (5 o 6 còpies de cada una) es ensamblan en la membrana interna de la bactèria, i l'evidència genètica sugerix que les porcions C terminals de p1 i p11 interaccionen en la porció N terminal de p4 en el periplasma. Estes proteïnes en conjunt, p1, p11, p4; formen un complex en forma de canal a través del com el fago madur és secretado del seu hospedador bacterià.
Excreció
[editar | editar còdic]Per a iniciar la secreció del fago, dos de les proteïnes menors de la envoltura: p9 i p7, interactuen en el complex format per ADN monocatenario i p5 a l'altura de la regió de l'ADN anomenada seqüència de empaque (també coneguda com a seqüència PS). Llavors les proteïnes p5 que recobrixen el #bri d'ADN monocatenario són reemplaçades per les proteïnes p8 que es troben empotrades en la membrana celular de la bactèria i el fago en creiximent és "hilado" en travessar el canal format per p1, p11 i p4. Este procés de tongada de p5 per p8 explica l'evidència de microfagos presentada anteriorment indicant com és que el tamany de la partícula viral es troba determinat pel número de bases empacadas dins del fago. Una volta que l'ADN viral es troba completament recobert en p8, es finalisa la secreció afegint els capuchones p3/p6 i el fago es desprén de la superfície bacteriana.
Replicació en I. coli
[editar | editar còdic]Davall es llisten els passos involucrats en la replicació del fago M13 en l'amfitrió I. coli.
- La cadena d'ADN viral (+) entra a la citoplasma.
- Les enzimes bacterianes sintetisen la cadena complementària (-).
- l'ADN girasa, una topoisomerasa tipo II, actua sobre l'ADN de doble cadena i cataliza la formació de superenrrollamientos d'ADN doble cadena.
- El producte final és la forma replicativa (RF) parental d'ADN.
- Una proteïna del fago, pII, fa una muesca en la cadena RF (+).
- L'extrem 3'-hidroxilo actua com cebador en la creació d'una nova cadena viral.
- La pII forma cadenes circulares a partir de la cadena (+) viral.
- Es produïx un reservorio de molècules RF de doble cadena com progenie.
- La cadena (-) de la RF funciona com a mòle per a la transcripció.
- Els ARNm són traduïts a proteïnes del fago.
- Els dímers pV unixen a les cadenes simples d'ADN recent sintetisades, i prevenen la conversiónn d'estes a ADN RF.
- La #síntesis d'ADN RF continua fins que pV alcança una concentració crítica
- La replicació de l'ADN canvia cap a la #síntesis d'ADN viral (+) de simple cadena.
- Es formen estructures de pV-ADN d'aproximadament 800 nm de llongitut i 8 nm de diàmetro.
- Els complexos pV-ADN servixen com a substrat per a la reacció de ensamble del fago.
M13 com a vector de clonació
[editar | editar còdic]Ya que l'ADN de M13 és monocatenario, este bacteriòfec és un vector convenient per a la clonació d'ADN. La llongitut del seu genoma no és fix i per lo tant és capaç d'acceptar ADN estrany sense comprometre la viabilitat del fago. Un vector de clonació particular que explota el cicle de vida del fago M13 es diu "fagémido".
El fagémido és una molècula circular d'ADN de doble cadena de plásmido que conté un orige de replicació (ori V) i l'orige de replicació de M13 pero que no conté els gens que codifiquen per a les proteïnes estructurals del fago. En un fagémido es pot clonar una seqüència d'ADN d'interés que es desija que s'expresse en una població de cèlules per mig de l'explotació de l'infecció per fagos. Degut a que el fagémido conté solament l'orige de replicació de fago, és incapaç de generar les proteïnes estructurals necessàries per a l'ensamblage del fago i per al empaquetamiento de l'ADN dins d'ell. Per esta raó, s'utilisa el fago auxiliar M13K07. Este fago conté un orige de replicació i de codificació per a totes les proteïnes estructurals necessàries per al montage de la forma infectiva del fago. Quan les cèlules que contenen el fagémido es superinfectan en M13K07, la Gp2 produïda pels gens del M13K07 reconeix com a seqüència d'orige de fago a la que es troba #present en el fagémido per lo que en conseqüència és capaç de replicar-se i d'empaquetar-se junt en les proteïnes estructurals codificades pel fago auxiliar.
Atres investigacions
[editar | editar còdic]George Smith, entre uns atres, va mostrar que els fragments produïts per l'endonucleasa EcoRI poden ser soldats en un lloc Bam únic dels fagos filamentosos f1, i per lo tant resultar expressats en el gen III; la proteïna del qual pIII resulta accessible des de l'exterior. Este no és l'únic lloc Bam existent en el gen III de M13.
Es pot modificar al M13 per a obtindre diferents llocs d'inserció accessibles, fent-ho útil en la seua flexibilitat per al maneig de insertos de diferent tamany. Degut a que el sistema d'expressió M13 permet una gran flexibilitat en la localzación i número de proteïnes recombinantes que poden obtindre's del fago, és una ferramenta popular per a la construcció i investigació de nanoestructuras.[2] per eixemple, el fago pot ser genèticament modificat per a expressar proteïnes diferents en els seus extrems i en el seu segment mig. Açò pot ser utilisat per a ensamblar estructures tals com nanocables d'or o òxit de cobalt per a la fabricació de bateries,[3] o per a empacar nanotubos en forma de manojos orientats per a la seua utilisació en celes fotovoltaiques.[4]
Enllaços
[editar | editar còdic]- 20.109(S07): Començant l'ingenieria de genomes (en anglés)[2]
- Expressió en fagos: Un manual de laboratori (en anglés)
- Included in DNA Sequencing Protocols by Griffin, Annette M.; Griffin, Hugh G. (large 21mb file)
Vore també
[editar | editar còdic]Referències
[editar | editar còdic]- ↑ [1]
- ↑ (2005).«Programmable Assembly of Nanoarchitectures Using Genetically Engineered Viruses».Nano Lett..5(7)
- 1429–1434.ISSN 1530-6984.doi:10.1021/nl050795d.
- ↑ «Virus-Enabled Synthesis and Assembly of Nanowires for Lithium Ion Battery Electrodes».Science.312(5775)
- 885–888.ISSN 0036-8075.doi:10.1126/science.1122716.Consultat el 23 de març de 2012.
- ↑ «Virus-templated self-assembled single-walled carbon nanotubes for highly efficient electron collection in photovoltaic devices».Nature Nanotechnology.6(6)
- 377–384.ISSN 1748-3387.doi:10.1038/nnano.2011.50.Consultat el 23 de març de 2012.
- Este artícul conté una traducció derivada de «Fago M13» de Wikipedia en castellà publicada baix la Llicència de documentació lliure de GNU i la Llicència Creative Commons Reconeiximent-CompartirIgual 4.0 Internacional.