Cpf1
Plantilla:Complex En la biologia molecular, Centromere i Promoter Factor 1 (en anglés), o Cpf1, és una única endonucleasa d'ARN guiat que li falta un menut ARN transcodificado, un tracrRNA, i que utilisa un motiu adjacent de protoespaciador rics en T[1] de 2-6 parell de bases de seqüència de ADN immediatament despuix de la seqüència d'ADN dirigida per la nucleasa Cas9 en el sistema bacterià adaptatiu immune CRISPR,[2] també conegut com PAM.[3] Reconeix un PAM ric en T, TTTN, pero en el costat 5 'de la guia. Cpf1 escindix el ADN a través d'una ruptura de doble cadena de ADN escalonat.[4] Actualment esta enzima rep el nom de Cas12a.[5]
Edició del genoma
[editar | editar còdic]De les 16 proteïnes de la família Cpf1, els científics varen identificar dos enzimes candidates de Acidaminococcus i Lachnospiraceae, en una eficient activitat d'edició del genoma en cèlules humanes. Cpf1 es va introduir en característiques que SpCas9 falta. Cpf1 requerix de només ARN curt de 42 nt de CRISPR (crARN) per a trobar el seu objectiu, en lloc del ARN guia de 100 nt del SpCas9, i reconeix un motiu adjacent de protoespaciador (PAM) que és 5' en lloc de 3' del lloc d'objectiu. [6]
Edició del genoma de Drosophila melanogaster
[editar | editar còdic]La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, ha segut objecte de multitut d'estudis genètics per a l'anàlisis de la funció d'una gran diversitat de gens. En un principi, el seu genoma era alterat en estudis de pèrdua de funció per mig de mutágenos que produïen canvis en la seua seqüència de ADN sense un control experimental estricte. Posteriorment, es varen desenrollar métodos més específics per mig de l'ocupació d'ARN interferente (RNAi) en combinació en el sistema GAL4-UAS, que permet una edició teixit específica. Per últim, el major descobriment en este àmbit va ser el del sistema CRISPR que, junt a la nucleasa Cas9, va supondre una revolució en l'edició gènica tant in vitro com in viu, per tractar-se d'una tècnica senzilla, específica i assequible a nivell experimental.[5]
En el continu alvanç de les tècniques d'edició gènica, es va propondre l'us d'atres nucleasas en funcions complementàries que permeteren abordar les llimitacions que Cas9 va ser plantejant. Aixina, va sorgir l'us de Cas12a en l'edició del genoma de D. melanogaster a partir de l'extreta de la bactèria Acidaminococcus (AsCas12a). No obstant, esta nucleasa presenta taxes d'edició molt baixes en comparació a Cas9, ya que la seua temperatura òptima es troba per damunt dels 30 °C (com posteriorment es va descobrir en el seu us en vertebrats). Posteriorment, es va procedir a l'utilisació d'una variant present en Lachnospiraceae bacterium (LbCas12a) demostrant millors taxes d'edició a temperatures més baixes, propenques a les de D. melanogaster.[5] Ademés, presenta una característica adicional en ser termosensible, mostrant diferències en la seua activitat davant llaugeres variacions tèrmiques. Esta característica aporta una nova variable a controlar que permet diversificar els possibles objectius experimentals.[7]
Mutació Cas12aD156R
[editar | editar còdic]Una mutació puntual trobada en la variant LbCas12a D156R, que representa la substitució de l'aminoàcit àcit aspártico per arginina en la posició 156 de la proteïna, va demostrar un aument en l'eficiència de brot en el model vegetal Arabidopsis thaliana, similar al que despuix es va corroborar en D. melanogaster. Esta mutació mostra una eficiència en la taxa d'edició gènica pròxima a l'observada en Cas9.[5]
Cas9 vs Cas12a (Cpf1)
[editar | editar còdic]| Funció | Cas9 | Cas12a (Cpf1) |
|---|---|---|
| Estructura | Dos ARN requerits (O 1 transcripció de fusió (crRNA + tracrRNA = sgRNA)) | Es necessita un ARN (crRNA) |
| Mecanisme de tall | Talles extrems romos | Corts extrems escalonats |
| Llocs de cort | Proximal al lloc de reconeiximent | Distal del lloc de reconeiximent |
| Llocs objectiu | PAM Ric en G ("NGG") | PAM Ric en T ("TTTV") |
| Tamany de deleción | 1-10 parells de bases | 10-15 parells de bases |
| Activitat nucleasa | ADNasa | ADNasa + ARNasa |
| Tipo de cèlula | Cèlules de creiximent ràpit, incloses les cèlules canceroses | Cèlules no divisòries, incloses les cèlules nervioses |
L'activitat adicional ARNasa, junt en el menut tamany de les seqüències crRNA, permet una major facilitat a l'hora de realisar edició de gens en multiplex. Ademés, Cas12a presenta una deleción de major tamany, associat a una major mutagenicidad.[5]
Sistema GAL4-UAS
[editar | editar còdic]Una de les ventages de la nucleasa Cas12a (LbCas12a) és la seua adaptació a l'edició teixit-específica per mig del sistema Gal4-UAS, per al que Cas9 presenta alguns inconvenients:[5]
| Funció | Cas9 | - | Toxicitat | Altes concentracions tòxiques (apoptosis i malformació del teixit) | Ben tolerada en varis teixits |
|---|---|---|---|---|---|
| Especificidad | Talles fora del teixit diana | Talles exclusivament en el teixit diana |
A la seua volta, junt en estes característiques, Cas12a presenta una alta efectivitat en l'inactivación gènica teixit-específica.[5]
Referències
[editar | editar còdic]- ↑ http://www.cell.com/abstract/___caps_4___(15)01200-3 Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System
- ↑ (2013).RNA Biology.10(5)
- 891–899.doi:10.4161/rna.23764.
- ↑ (2015).Cell.163(3)
- 759–771.doi:10.1016/j.cell.2015.09.038.
- ↑ «Using Cpf1 for CRISPR». Benchling.
- ↑ 5,0 5,1 5,2 5,3 5,4 5,5 5,6 117(39)
- 24019-24021.doi:10.1073/pnas.2016446117.Consultat el 18 de giner de 2021.
- ↑ (2016).Nature Methods.13(714)doi:10.1038/nmeth.3979.
- ↑ 117(37)
- 22890-22899.doi:10.1073/pnas.2004655117.Consultat el 25 de giner de 2021.
- Este artícul conté una traducció derivada de «Cpf1» de Wikipedia en castellà publicada baix la Llicència de documentació lliure de GNU i la Llicència Creative Commons Reconeiximent-CompartirIgual 4.0 Internacional.