Anar al contingut

Bloqueig de gens

De L'Enciclopèdia, la wikipedia en valencià
A la rata de l'esquerra se li ha bloquejat un gen del creiximent de pèl, mentres que el de la dreta és una rata normal

El bloqueig de gens, també cridat inactivación gènica o desactivació gènica (en anglés, gene knockout) és una tècnica genètica que consistix en suprimir l'expressió d'un gen específic en un organisme, substituint el gen original en el seu locus per una versió modificada del mateix, a la que s'ha extret un o varis exones , d'esta forma, s'obtenen organismes que no expressen el gen en un teixit específic o en l'organisme complet. A estos organismes se'ls crida igualment knockout, com és el cas dels rates knockout.[1][2]

Un organisme knock-in és igual a l'anterior pero en lloc d'eliminar un gen determinat est és reemplaçat per una versió modificada del mateix, que produïx una funció adicional.

Métodos

Existixen diferents tècniques de biologia molecular per a interferir en l'expressió d'un gen. Estes tècniques varien en les ferramentes utilisades, en el temps necessari per a conseguir un resultat positiu i en la especificidad del mateix. Dins d'estes tècniques es troben:

  • Recombinació homòloga: Es reemplaça el gen original per una versió mutada. Esta versió mutada pot eliminar pràcticament tota la seqüència del gen o be deixar l'expressió dels primers exones. Solen requerir-se varis mesos per a obtindre individus modificats (sobretot en el cas dels rates), encara que presenten la ventaja de ser molt específics: estos organismes únicament presenten carència del gen objectiu.
  • Transgénesis a on s'introduïxen seqüències dins del gen original que ho alteren, per a produir modificacions que generen proteïnes no funcionals. Sol ser una tècnica més ràpida, l'inconvenient de la qual és que el gen endógeno encara està present, i pot produir una proteïna, encara que mutada, que pot interferir en atres molècules de la via a la que pertany. Ademés, pot produir-se per encert una nova mutació que revertixca la modificació introduïda, generant de nou la proteïna original, succés que té lloc en una certa freqüència.
  • Mutagénesis. Es poden obtindre mutantes utilisant un producte mutagénico (com l'EMS), que produïxen mutacions a l'encert. I se seleccionen despuix organismes que duguen codones "STOP" en la seqüència d'interés. És un método ràpit d'obtindre mutantes, encara que no és específic per al gen objectiu, lo que pot generar contratemps.
  • Knockdown. (Artícul principal Knockdown de gens) Es poden introduir en el genoma d'un organisme seqüències de ADN que expressen molècules d'ARN interferente o introduir-les directament en les cèlules. Estes molècules interferixen de forma específica en l'expressió del gen diana, produint generalment una disminució de l'expressió (que es denomina "knockdown" per este motiu). Esta tècnica és més ràpida que l'obtenció d'un organisme "knockout", pero no produïx una eliminació completa de l'expressió i ademés la seqüència introduïda que codifica per a el ARN interferente pot també sofrir mutacions, inactivando l'efecte desijat.

Producció d'organismes Knockout

Procediment per a generar blastocitos de genotip mixt.

En 2007, Mario Capecchi, Martin Evans, i Oliver Smithies varen obtindre el Premie Nobel en Fisiologia o Medicina pel desenroll de tècniques de modificació genètica específiques i tecnologia de cèlules mare embriòniques de rata (cèlules ES) que, combinades, varen permetre la generació dels rates knockout (rates en gens bloquejats). L'anàlisis d'estos animals mutantes ha revolucionat la elucidación de la funció dels gens, i estes rates han demostrat ser un valiós model de numeroses malalties humanes.[3][4][5][6][7][8][9][10][11]

Esquema de creus per a obtindre rates en gens bloquejats. Blastocitos que contenen cèlules tant no modificades com bloquejades, s'injecten en l'úter d'una mare portadora. Esta produïx una descendència que és ben tipo salvage (no modificats, del mateix color que el blastocito donant (gris)) o be és una quimera (mescla) (parcialment bloquejada). Les rates quimera es creuen en una rata normal grisa. Este creuament produïx una descendència de rates blanques (heterocigotos per al gen bloquejat) o ben grisos (normals). Les rates blanques heterocigotos es creuen despuix entre sí per a obtindre rates que són homocigotos per al gen bloquejat o més be, suprimit.

El procediment general per a produir un organisme Knockout és:

  1. El gen modificat (que carix la major part de la seqüència del gen original) s'introduïx en un plásmido, per a generar un vector direccionador (targeting vector). En dit vector, el gen modificat està controlat per un promotor que permet l'expressió del gen de forma ben constitutiva (contínua durant tot el desenroll de l'animal), ben condicional (depenent de la presència o no d'una substància concreta que actua com activador o inhibidor, com la tetraciclina; això permet expressar el gen únicament en una etapa del desenroll o en un teixit concret). Ademés, en el vector direccionador el gen modificat està flanquejat per fragments dels braços cromosòmics confrontants del locus del gen d'interés (en posició 5' i en posició 3'). Tant el gen d'interés com els braços cromosòmics s'obtenen a partir d'un fragment del genoma de la zona corresponent, per eixemple a partir d'un BAC; el gen d'interés es modifica per mig de tècniques de biologia molecular, i els tres components (el gen modificat i els braços) s'introduïxen (es subclonan) en el plásmido. Aixina mateix, el plásmido deu incloure la presència d'un marcador (normalment la resistència a un antibiòtic) que permeta seleccionar les cèlules que han incorporat el gen modificat. Hi ha diferents variants de plásmidos disponibles, en funció de la tècnica concreta que es vaja a utilisar per a crear el vector direccionador.
  2. Una volta construït el vector direccionador (un procés complex que pot implicar varis mesos de treball), este s'afig a un cultiu de cèlules embrionàries ES (stem cells, cèlules mare), i s'incorpora a les cèlules per mig de transfección. El vector direccionador pot reconéixer (per emparellament de bases) la zona del locus d'interés, de manera que per mig del mecanisme de recombinació homòloga, es pot produir un intercanvi entre el vector direccionador (que rep el gen endógeno) i el locus genómico (que rep el gen modificat no funcional). Per este motiu, quant més llargues siguen les seqüències dels braços d'homologia que flanquegen al gen modificat, major serà la provabilitat de que es produïxca recombinació homòloga (i per tant apareguen cèlules en el gen modificat), encara que això aumenta la dificultat de construcció del vector direccionador.[12]
  1. Les cèlules ES transfectadas se someten llavors a selecció, utilisant l'antibiòtic corresponent, de manera que només sobreviuen les que hagen incorporat en el seu genoma el gen modificat (si el vector no s'ha recombinado, es diluïx despuix d'un cert número de divisions celulars). Les cèlules que sobreviuen al procés de selecció es verifiquen per mig de Southern Blot, una tècnica de biologia molecular que permet verificar la presència d'una molècula de ADN concreta en una mostra de ADN (el Southern blot combina la separació de fragments de ADN per mig d'electroforesis en geles de agarosa en métodos per a transferir els fragments de ADN separats per tamany a una membrana, que es hibrida en una sonda específica per a detectar la presència de la molècula d'interés).
  2. Una volta verificat que les cèlules embrionàries ES efectivament han substituït el gen endógeno pel gen modificat no funcional, algunes d'estes cèlules ES es inoculan a blastocitos, que són transplantats a femelles pseudopreñadas (en el cas de rates). Els organismes en gens bloquejats (organismes knockout) s'utilisen per a estudiar el rol funcional d'un determinat gen per defecte, estudiant les diferències entre l'organisme knockout i individus normals del mateix cep.


Referències

  1. ↑ Capecchi, M. R.(1989-06-16).«Altering the genome by homologous recombination».Science (New York, N.Y.).244(4910): 1288–1292.ISSN 0036-8075.doi:10.1126/science.2660260.Consultat el 2023-03-23.
  2. ↑ Capecchi, M. R.(Març de 1989).«The new mouse genetics: altering the genome by gene targeting».Trends in genetics: TIG.5(3): 70–76.ISSN 0168-9525.doi:10.1016/0168-9525(89)90029-2.Consultat el 2023-03-23.
  3. ↑ Houdebine, Louis-Marie(2007).«Transgenic animal models in biomedical research».Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.).360: 163–202.ISSN 1064-3745.doi:10.1385/1-59745-165-7:163.Consultat el 2023-03-23.
  4. ↑ Green, Jeffrey E.; Hudson, Tamaro(Març de 2005).«The promise of genetically engineered mice for cancer prevention studies».Nature Reviews. Cancer.5(3): 184–198.ISSN 1474-175X.doi:10.1038/nrc1565.Consultat el 2023-03-23.
  5. ↑ McCormack, E.; Bruserud, O.; Gjertsen, B. T.(2008-06-19).«Review: genetic models of acute myeloid leukaemia».Oncogene.27(27): 3765–3779.ISSN 1476-5594.doi:10.1038/onc.2008.16.Consultat el 2023-03-23.
  6. ↑ Øvlisen, K.; Kristensen, A. T.; Tranholm, M.(Març de 2008).«In viu models of haemophilia - status on current knowledge of clinical phenotypes and therapeutic interventions».Haemophilia: The Official Journal of the World Federation of Hemophilia.14(2): 248–259.ISSN 1365-2516.doi:10.1111/j.1365-2516.2007.01636.x.Consultat el 2023-03-23.
  7. ↑ Boehncke, Wolf-Henning; Schön, Michael P.(2007).«Animal models of psoriasis».Clinics in Dermatology.25(6): 596–605.ISSN 0738-081X.doi:10.1016/j.clindermatol.2007.08.014.Consultat el 2023-03-23.
  8. ↑ Chen, Duan; Zhao, Chun-Mei(Novembre de 2007).«Genetically engineered mice: a new paradigm to study gastric physiology».Current Opinion in Gastroenterology.23(6): 602–606.ISSN 0267-1379.doi:10.1097/MOG.0b013i3282f01dbd.Consultat el 2023-03-23.
  9. ↑ Lacroix-Fralish, Michael L.; Ledoux, Jean B.; Mogil, Jeffrey S.(Setembre de 2007).«The Pain Gens Database: An interactive web browser of pain-related transgenic knockout studies».Pain.131(1-2): 3.i1–4.ISSN 1872-6623.doi:10.1016/j.pain.2007.04.041.Consultat el 2023-03-23.
  10. ↑ Takao, Keizo; Yamasaki, Nobuyuki; Miyakawa, Tsuyoshi(Juny de 2007).«Impact of brain-behavior phenotypying of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders».Neuroscience Research.58(2): 124–132.ISSN 0168-0102.doi:10.1016/j.neures.2007.02.009.Consultat el 2023-03-23.
  11. ↑ Fievet, Catherine; Fruchart, Jean-Charles; Staels, Bart(2007-05-01).[https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17485363/ «Genetically-engineered animals as research models for atherosclerosis: their use for the characterization of PPAR agonists in the treatment of cardiometabolic disorders»].Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library.12: 4132–4156.ISSN 1093-9946.doi:10.2741/2376.Consultat el 2023-03-23.
  12. ↑ Glaser, Stefan; Anastassiadis, Konstantinos; Stewart, A. Francis(Novembre de 2005).«Current issues in mouse genome engineering».Nature Genetics.37(11): 1187–1193.ISSN 1061-4036.doi:10.1038/ng1668.Consultat el 2023-03-23.
Obtingut de «https://lenciclopedia.org/w/index.php?title=Bloqueig_de_gens&oldid=1579949»