Cèlula mare pluripotente induïda

Esquema de la generació de cèlules mare pluripotenciales induïdes (iPS) a partir de cèlules adultes (reprogramación). (1) S'aïllen i cultiven les cèlules adultes que es van a utilisar com . (2) Es fa la transferència de genés exógenos provinents de cèlules mares a les cèlules per mig de vehículs retrovirales. Les cèlules de color roig indiquen que són cèlules transfectadas que ya expressen els gens exógenos. (3) Es cultiven les cèlules transfectadas en métodos de cultiu de cèlules mare usant cèlulas inactivadas com a capes alimentadoras (color gris). (4) Un subgrup chicotet d'estes cèlules transfectadas es transformen en cèlules mares pluripotenciales induïdes (iPS) i des d'eixe moment en avant produïxen colónies de cèlules mare.

Les cèlules mare pluripotentes induïdes (normalment abreviades com a cèlules iPS, per les seues sigles en anglés: "induced Pluripotent Stem" ) són un tipo de cèlules mare en característiques pluripotenciales (capaces de generar la majoria dels teixits) derivades artificialment d'una cèlula que inicialment no era pluripotencial. Per lo general s'utilisa com una cèlula adulta diferenciada (diferenciació celular) procedent d'un teixit, sobre la que s'induïx l'expressió de varis genés exógenos, tals com Oct4, Sox2, c-Myc i Klf4, capaces de dones-diferenciar-la. Es denomina reprogramación a esta desdiferenciación. Les cèlules iPS són capaces: a) de diferenciar-se en cèlules de teixits pertanyents a les tres capes germinals d'un embrió natural (vore embriogénesis humana): endodermo, mesodermo i ectodermo, b) de formar teratomas, i c) rates quiméricos o quimeres (quimerismo).

S'ha demostrat que les cèlules iPS són idèntiques en molts aspectes, i similars en uns atres, a les cèlules mare embrionàries (normalment abreviades com ES, per les seues sigles en anglés: "Embryonic Stem"). Per eixemple, són iguals en morfologia, expressió de certs gens i proteïnas, patrons de metilación del ADN, temps de duplicació celular i capacitat de diferenciació a cèlules d'atres teixits. No obstant, el mecanisme per mig del qual s'induïxen i la seua relació en les cèlules ES seguix encara en investigació (Liu, et al. 2011).

Les cèlules iPS es varen obtindre per primera volta en l'any 2006 a partir de cèlules de rates (Takahashi & Yamanaka, 2006), i en 2007 a partir de cèlules humanes (Takahashi, et al. 2007). En 2006, es va descriure per primera volta este procés a partir de fibroblastos de rata utilisant retrovirus que vehiculizaban i induïen l'expressió de varis gens exógenos. En 2011 es va publicar una revisió sobre esta primera metodologia (Miller & Schlaeger, 2011). Este guany es considera un dels alvanços més importants de l'investigació en cèlules mare, ya que permet obtindre cèlules mares pluripotenciales a partir de cèlules adultes. Les iPS tenen aplicacions com a models per a estudi de malalties, possibles usos terapèutics (disminuint el rebuig en els transplants i sense la controvèrsia de l'us d'embrions que té les cèlules ES), i en investigacions bàsiques.

Shinya Yamanaka i John Gurdon varen ser guardonats en 2012 en el premie nobel de Fisiologia o Medicina.

Primers métodos d'reprogramación de cèlules adultes

Esquema de la generació de cèlules de teixits diferenciades a partir de les cèlules mare naturals. . Totes les cèlules adultes que componen un cos de rata o humà es generen a partir d'una cèlula inicial totipotencial a través de cèlules mare pluripotenciales, que solament persistixen en l'época embrionària (cèlules ES), i despuix a partir de cèlules mare multipotenciales que persistixen en l'adult. La reprogramación de cèlules adultes a cèlules pluripotenciales (cèlules iPS) ha conseguit la reversibilidad parcial d'este procés natural de diferenciació celular

Primera generació en rates

Les cèlules iPS es deriven de cèlules adultes per transferència (transfección) de varis gens exógenos associats a cèlules ES. Generalment per a una transferència eficient s'utilisen retrovirus que actuen com a vehículs o vectores dels gens exógenos. Els gens exógenos transferits són principalment els corresponents a factors de transcripció (transcripció genètica) associats a les cèlules ES. Despuix de 3–4 semanes , un chicotet percentage de les cèlules transferides comencen a diferenciar-se tornant-se morfològica i bioquímicamente similars a les cèlules ES. Les cèlules iPS o cèlules adultes reprogramades s'aïllen per selecció en un gen de resistència a antibiòtics i per confirmació de la seua identitat (vore despuix).

L'equip de Shinya Yamanaka en l'Universitat de Kyoto (Japó) en 2006, va anar el primer en generar cèlules iPS. Per a això varen usar com a cèlules diana fibroblastos de rata, com a gens exógenos els prèviament identificats com expressats en les cèlules ES, i com a vehículs o vectores els retrovirus. Quatre gens codificant factors de transcripció varen resultar essencials per a produir cèlules iPS: els denominats Oct-3/4, Sox2, c-Myc, i Klf4. De les cèlules tractades en retrovirus codificant dits gens es varen seleccionar aquelles que els expressaven en antibiòtics i per la presència del gen Fbx15(cèlules Fbx15⁺) . No obstant estes cèlules iPS tenien patrons de metilación de el ADN distints dels de les cèlules ES i ademés no produïen rates quiméricos viables.

Segona generació en rates

En 2007, el mateix grup va publicar un treball junt en atres grups d'investigació independients d'Harvard, MIT, i l'Universitat de Califòrnia, que demostrava que es podien obtindre cèlules iPS a partir de fibroblastos de rata en capacitat de formar quimeres viables utilisant el gen Nanog en lloc del Fbx15. Els patrons de metilación de DNA i la producció de rates quiméricos viables varen indicar que Nanog és un determinant important de la pluripotencia celular (Maherali, et al. 2007, Okita, et al. 2007, Takahashi &Yamanaka, 2006, Wernig, et al. 2007). Desafortunadament, degut a que un dels quatre gens utilisats (c-Myc) és oncogénico, el 20% de les rates quiméricos va desenrollar càncer. En un estudi posterior, es va demostrar que es poden mantindre cèlules iPS sense c-Myc que no desenrollen càncer, pero el procedimento és menys eficient (Nakagawa, et al. 2008).

Producció de cèlules iPS humanes

En 2007, també es va publicar l'alvanç més important, ya que s'havien pogut generar cèlules iPS humanes a partir de cèlules humanes adultes. Els resultats es varen obtindre per dos equips d'investigació independents. Un dirigit per Yamanaka en Japó va transformar fibroblastos humans en cèlules iPS utilisant els gens: Oct3/4, Sox2, Klf4, i c-Myc vehiculizados en retrovirus (Takahashi, et al. 2007), mentres un atre per Thomson en USA va usar els gens Oct4, Sox2, Nanog, i LIN28 vehiculizados en lentivirus (Yu, et al. 2007).

Problemes dels primers métodos d'reprogramación celular

Encara que els primers métodos utilisant gens codificadores de factors de transcripció varen demostrar que les cèlules adultes diferenciades es poden reprogramar a cèlules iPS, encara existixen problemes importants, tals com a i) eficiència, ii) mutagénesis insercional, iii) tumors i iv) reprogramación incompleta.

• Eficiència: és un problema que afecta al procés d'obtenció de cèlules iPS. L'eficiència o percentage d'obtenció de cèlules reprogramades és encara molt baix. Per eixemple, el percentage d'reprogramación en l'estudi en rates de Yamanaka va ser sol del 0.1-1% (Takahashi &Yamanaka, 2006). Este percentage tan baix pot deure's a la necessitat de que coincidixquen distints nivells d'expressió de varis dels gens exógenos transfectados. També podria ser per la necessitat de canvis genètics o epigenéticos en la població de cèlules diana tal i com sugerix la necessitat de temps llarcs de cultiu. L'optimisació de la reprogramación seguix sent objecte d'estudis actuals (Chen, et al. 2011, Dick, et al. 2011) i constantment es produïxen nous alvanços. Per eixemple, per a obtindre una màxima eficiència, en els primers métodos descrits es necessitava créixer les cèlules iPS sobre una capa de cèlules alimentadoras que encara que inactivadas suponien una possible font de contaminació. Nous métodos , han conseguit fer créixer cèlules iPS en absència de dites capes en bones condicions (Chung, et al. 2011) i durant temps llarcs (Nemati, et al. 2011) .

• Mutagénesis insercional: és un problema que afecta a les possibles aplicacions en medicina regenerativa. L'inserció dels gens exógenos codificantes dels factors de transcripció en el genoma de la cèlula diana llimita la seua utilitat pel risc de mutagénesis insercional en el genoma de les cèlules diana (Selvaraj, et al. 2010). Les mutacions introduïdes poden ser deletéreas o induir tumors. Una estratègia per a evitar la mutagénesis insercional és l'us de vectores alternatius. Per a això s'han explorat plásmidos , adenovirus, i transposones, que encara que reduïxen les possibilitats de mutagénesis insercional, tenen una eficiència d'reprogramación menor (Okita, et al. 2008, Stadtfeld, et al. 2008, Woltjen, et al. 2009). Atres estratègies que ampren proteïnas o ARN també tenen una eficiència menor. Per últim, l'ocupació de molècules de baix pes molecular que simulen l'efecte dels factors de transcripció sembla hui per hui l'alternativa més esperançadora.

• Tumors: és un problema que afecta a les possibles aplicacions en medicina regenerativa. Alguns dels gens reprogramadores són oncogenes, lo que aumenta la provabilitat d'inducció de tumors. Encara que es va poder eliminar el c-Myc despuix de generar cèlules iPS per a eliminar la formaciónde tumors (Nakagawa, et al. 2008), es necessita profundisar en estos estudis. Sembla existir un equilibri entre l'eficiència d'reprogramación i la formació de tumors, ya que la inactivación o eliminació del gen supresor de tumors p53, aumenta l'eficiència d'reprogramación (Marion, et al. 2009).

• Reprogramación incompleta: és un problema que afecta a les possibles aplicacions en medicina regenerativa. Per a reprogramar completament una cèlula diferenciada d'un tipo celular a un atre, el còdic epigenético causant de la diferenciació celular deu ser "reformateado", lo que no sempre es conseguix al 100% depenent de cada tipo de cèlula diana (Kim, et al. 2011). A pesar d'estos inconvenients, tres equips independents varen ser capaços de generar cèlules iPS que varen donar orige a rates derivades enterament de cèlules iPS injectant-los a blastocistos tetraploides (Zhao, et al. 2009). No obstant, estudis dels perfils de transcripció han demostrat que dita equivalència no sempre és completa (Li, et al. 2011, Narsinh, et al. 2011).