Ensaig d'aberracions cromosòmiques en mamífers (OCDE 473)

El ensaig d'aberracions cromosòmiques en mamífers és un ensaig in vitro que té com a objectiu identificar els agents que causen aberracions cromosòmiques estructurals en cèlules de mamífer en cultiu.

Estes aberracions poden ser de dos tipos: cromosòmiques (alteracions estructurals o numèriques dels cromosomes) o cromàtiques. En la majoria dels mutágenos químics, les aberracions induïdes són de tipo cromàtic, pero també es poden produir aberracions de tipo cromosòmic.

Esta prova, per tant, s'utilisa per a detectar possibles mutágenos i carcinógenos per als mamífers. No obstant, no existix una correlació perfecta entre esta prova i la carcinogenicidad.

Condicions generals

1. <o>Cèlules</o>: Poden utilisar-se diverses llínees celulars, ceps o cultius celulars primaris, incloses les cèlules humanes (per eixemple, fibroblastos d'hàmster chinenc o limfocits de sanc perifèrica humana).
2. <o>Mijos i condicions de cultiu</o>: Deuen utilisar-se mijos de cultiu i condicions d'incubació adequats (recipients de cultiu, concentració de CO2, temperatura i humitat). Cal conéixer la duració normal del cicle celular i les condicions de cultiu utilisades.
3. <o>Preparació dels cultius</o>:
   • Llínees i ceps celulars establits: les cèlules es propaguen a partir de cultius mare, se sembren en un mig de cultiu a una densitat en la que els cultius no s'apleguen a mesclar i es incuban a 37 °C.
   • Limfocits: la sanc total tractada en un anticoagulant (com a heparina) o els limfocits separats obtinguts de subjectes sans s'afigen a un mig de cultiu que conté un mitógeno (per eixemple, fitohemaglutinina) i es incuban a 37 °C.
4. <o>Activació metabòlica</o>: Les cèlules deuen expondre's a l'agent mutágeno d'ensaig tant en presència com en absència d'un sistema d'activació metabòlica adequat. El sistema més utilisat és una fracció postmitocondrial suplementada en cofactores (S9) preparada a partir de feges de rosegadors tractats en agents inductores d'enzimes com el Aroclor 1254 o una combinació de fenobarbitona i ß-naftoflavona. La fracció postmitocondrial sol utilisar-se en concentracions entre l'1 i el 10% v/v en el mig d'ensaig final.

1. <o>Substància d'ensaig/preparació</o>: Les substàncies d'ensaig sòlides deuen dissoldre's o suspendre's en dissolvents o vehículs adequats i diluir-se, si procede, abans del tractament de les cèlules. Les substàncies d'ensaig líquides poden afegir-se directament als sistemes d'ensaig i/o diluir-se abans del tractament.
2. <o>Dissolvent o vehícul</o>: No deu ser sospitós de reaccionar químicament en la compost d'ensaig i deu ser compatible en la supervivència de les cèlules i l'activitat  S9. Si s'utilisen atres dissolvents/vehículs que no siguen coneguts, la seua inclusió deu estar respalada per senyes que indiquen la seua compatibilitat. Es recomana que, sempre que siga possible, es considere en primer lloc l'us d'un dissolvent/vehícul acuoso. Quan s'ensagen substàncies inestables en aigua, els dissolvents orgànics utilisats deuen estar lliures d'aigua, que pot eliminar-se afegint un tamís molecular.
3. <o>Controls</o>: Es deuen incloure controls tant positius com a negatius (dissolvent o vehícul) en i sense activació metabòlica. Quan s'utilise l'activació metabòlica, el producte químic de control positiu deu ser el que requerix l'activació per a donar una resposta mutagénica. Ademés, els controls positius deuen amprar un clastógeno conegut a nivells d'exposició que s'espera que donen un aument reproduible i detectable per a demostrar la sensibilitat del sistema de prova.

Procediment

Els cultius celulars s'exponen a l'agent d'ensaig en i sense activació metabòlica. A intervals predeterminats despuix de l'exposició dels cultius celulars al compost d'ensaig, es tracten en una substància de detenció de la metafase (per eixemple, Colcemid® o colchicina). A continuació, s'arrepleguen, s'teñir i s'analisen les cèlules en metafase al microscopi per a detectar la presència d'aberracions cromosòmiques.