Seqüenciació SOLiD

La seqüenciació SOLiD (del anglés Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection), també cridada de 2 base encoding (codificació en dos bases), és una tècnica de seqüenciació de ADN de pròxima generació desenrollada per Life Technologies i disponible comercialment des de 2006. Esta tècnica genera centenars de millons de menudes llectures de seqüència al mateix temps.

Les llibreries poden ser secuenciadas fins a per 8 sondes de ligación (método de seqüenciació en escala). Ademés, permet elegir com a llibreria fragments de preparació d'una llibreria o una llibreria completa. En abdós casos, el ADN diana s'ajusta un tamany específic per mig de la ligación d'adaptadors en els extrems dels fragments resultants.

El cost de seqüenciació és d'aproximadament 40x10-9 dólars per base, a l'hora que aumenta la capacitat de secuenciar des de 1 000 000 bases/màquina/dia a 500 0000 000 bases/màquina/dia. En vàries publicacions es menciona el seu us en diversos processos,ya que es pot secuenciar el genoma complet, trobem estudis que van des d'investigacions del transcriptoma (inclosos perfils d'expressió gènica, anàlisis de ARN menuts i anàlisis de transcriptoma complet) ,epigenoma (com ChIPSeq i metilación) fins a resecuenciación dirigida .

La llongitut de llectura de SOLiD va ser inicialment de 35 pb.

La seqüenciació per ligación usada té alguns problemes a l'hora de secuenciar palíndroms. Un dels problemes comuns de les tècniques NGS és la representació insuficient o excessiva de GC o AT ric seqüències. Estos biaix a sovint es generen durant preparació de la biblioteca, principalment quan les biblioteques se someten a una reacció en cadena d'polimerasa (PCR) exclusiva, mentres que es creu que les biblioteques lliures de PCR es secuencian en significativament menys o casi sense biaix. No obstant, cal destacar que SOLiD com la plataforma ideal d'elecció per a investigadors que tracten en organismes en un similar gama de contingut de GC.

Procediment

A partir de la mostra que es vol secuenciar es prepara una llibreria de fragments de ADN per mig de sonicación o disrupción física, els quals s'usaran per a preparar poblacions de clons en perles magnètiques. Els fragments units duen una seqüència adaptadora universal P1 per a que la seqüència inicial de cada fragment siga coneguda i idèntica.

Cada molècula s'amplifica clonalmente en una reacció de PCR per emulsió en microrreactores en aigua en oli que contenen tots els reactius necessaris (perles unides a P1, mòle, components de PCR i primers). S'enriquixen les gotes en la seqüència diana. Els productes de PCR són seleccionats per tamany per a obtindre un tamany adequat i s'unixen covalentemente a un cristal.

S'afigen primers universals que hibridan en la seqüència adaptadora del mòle de la llibreria. Quatre tipos de sondes de dos bases marcades en fluorescència competixen per la ligación al primer usat per a secuenciar. L'estructura d'estes sondes seria la següent: lloc de ligación en la primera base, lloc d'escissió en la quinta base i 4 tenyides fluorescents diferents (units en l'última base). La especificidad es conseguix interrogant cada primera i segona base en la reacció de ligación. Es realisen varis cicles de ligación, detecció i trencament. Despuix de cinc cicles en dèu reaccions de ligación cada u, el producte d'extensió s'elimina i el mòle es torna a usar en un primer complementari a la posició n-1 per a una segona ronda de cicles.

Per a cada seqüència s'usen cinc rondes de cicles. En estes repeticions s'interroga cada base en dos reaccions de ligación independents per dos primers diferents. Este método genera 60 gigabases de senyes de ADN per us. Pel sistema de dos bases de repetició dels cicles de ligación, es té una precisió del 99,94%. Ademés, s'evita el problema del sistema Roche 454 FLX per a secuenciar regions en repeticions d'homopolímers.

La senyal fluorescent es grava durant la ligación i la neteja de les tres últimes bases de la sonda. Per a interpretar estes senyals de fluroescencia, un software convertix les seqüències de bases de referència en una seqüència de codificació de colors. Després, esta codificació de color de recuencias de referència es compara en la de la mostra per a obtindre l'informació del mapage per mig d'un algoritme específic.

Aplicacions

Ademés de la seqüenciació, esta tècnica pot usar-se en transcriptómica i epigenética.

La transcriptómica està llimitada pels microarrays, pero en la seqüenciació de pròxima generació el transcriptoma complet de qualsevol organisme pot ser secuenciado d'una sola volta, obtenint-se l'identificació de cada tránscrito, aixina com el perfil d'expressió.

La seqüenciació de pròxima generació també pot ser usada en inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) per a determinar els llocs d'unió de factors de transcripció ademés d'interaccions proteïna-ADN.

Podem també trobar aplicacions d'esta tècnica en el posicionament de nucleosomas, seqüenciació de ARN de cadena sensible, i la més directa, seqüenciació humana.