Seqüenciació SMRT
La Seqüenciació SMRT (de l'anglés single molecule real clave sequencing) o seqüenciació a temps real d'una única molècula de ADN és una tecnologia de seqüenciació per síntesis d'una molècula de ADN fixa desenrollada per Pacific Biosciences. Utilisa la guia d'ona de "modo zero" (ZMW), desenrollada en els laboratoris d'Harold G. Craighead i Watt W. Webb[1] en l'Universitat de Cornell. En el fondo de la ZMW es fixa una ADN polimerasa en una molècula de ADN mòle. La ZMW permet l'estudi d'un únic nucleòtit incorporat a la polimerisació. Cada una de les quatre bases nitrogenades de el ADN es marca en un fluoróforo diferent. Aixina, quan un nucleòtit s'incorpora a la cadena incipient, es llibera el fluoróforo i s'observa una senyal que és arreplegada en un detector. La primera seqüència obtinguda a través de seqüenciació SMRT va ser publicada en giner de 2009 en la revista Science.[2]
Tecnologia
[editar | editar còdic]La seqüenciació es realisa sobre un chip que conté moltes ZMW. Dins de cada una d'elles es troben fixes una ADN polimerasa activa i una molècula de ADN mòle de cadena senzilla. La ZMW permet que la llum penetre i es creu un espai de visualisació que permet monitorizar l'activitat de la ADN polimerasa. La senyal procedent de l'incorporació d'un nucleòtit per part de la ADN polimerasa es detecta durant la síntesis de ADN, d'ahí que es tracte d'una seqüenciació a temps real.
Nucleòtit modificat
[editar | editar còdic]Cada una de les quatre bases nitrogenades que formen part de el ADN es troba marcada en una molècula fluorescent diferent que permet la seua identificació durant la seqüenciació per síntesis. La molècula fluorescent s'unix al grup fosfat del nucleòtit, i quan este s'incorpora a la cadena de ADN, el complex fluoróforo-fosfat és lliberat com a conseqüència de la formació de l'enllaç fosfodiéster que té lloc durant l'elongació de la cadena de ADN. Posteriorment, la senyal de fluorescència difon fòra de l'àrea de detecció i no es detecta més.
Guia d'ona "modo zero" (ZMW)
[editar | editar còdic]La guia d'ona "modo zero" (ZMW) és una estructura de confinament de nanofotones que consistix en una cavitat circular recoberta d'una película d'alumini sobre un substrat de sílice.[3] Les cavitats tenen 70 nm de diàmetro i 100 nm de profunditat. El camp òptic de la cavitat disminuïx exponencialment dins de la cavitat pel comportament de la llum en travessar una obertura menuda.[4] El volum de cavitat observable dins d'una ZMW allumenada és de 20·10^-21 litros, que permet la llectura de l'activitat de la polimerasa.
Taxa de Seqüenciació
[editar | editar còdic]La taxa de seqüenciació es medix en térmens de tamany de llectura del fragment i rendiment total de la prova.
Pacific Biosciences va comercialisar la seqüenciació SMRT en 2011,[5] despuix del llançar una versió beta del seqüenciador a finals de 2010.[6] El tamany de llectura mija va ser d'1,1 kb. En un nou kit comercial a principis de 2012 es va conseguir incrementar dita sifra fins a 2,5-2,9 kb.[7] A finals del mateix any, un kit XL va aumentar el valor fins a més de 4,3 kb.[8][9] El kit P4 d'agost de 2013 va conseguir llectures de més de 5 kb en combinació en el kit XL,[10] i inclús de prop de 7 kb si s'acopla en un sistema selectiu de tamany de ADN (com la electroforesis BluePippin).[11]
El rendiment total de la prova es veu influït pel tamany dels fragments secuenciados aixina com pel pocillo de SMRT. El pocillo prototip contenia prop de 3000 ZMW, mentres que el comercialisat posseïx 150000 ZMW que es lligen en dos rondes de 75000.[12] En abril de 2013 la companyia va comercialisar una nova versió del seqüenciador (PacBio RS II) que usa les 150000 ZMW al mateix temps, duplicant aixina el rendiment.[13][14] El major rendiment s'ha conseguit en novembre de 2013 utilisant sistema d'unió P5, química C3, selecció de tamany BluePippin i un PacBio RS II de 350 Mb per pocillo SMRT. El rendiment varia segons el tipo de mostra que se seqüència.
Referències
[editar | editar còdic]- ↑ M.J. Levene, J. Korlach, S.W. Turner, M. Foquet, H.G. Craighead, W.W. Webb, Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299 (2003) 682-686
- ↑ Real-Clave DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules
- ↑ J. Korlach, P.J. Marks, R.L. Cícero, J.J. Gray, D.L. Murphy, D.B. Roitman, T.T. Pham, G.A. Otto, M. Foquet, S.W. Turner, Selective aluminium passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures. PNAS. 105 (2008) 1176-1181
- ↑ M. Foquet, K.T. Samiee, X. Kong, B.P. Chauduri, P.M. Lundquist, S.W. Turner, J. Freudenthal, D.B. Roitman, Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-molecule detection. Journal of Applied Physics. 103 (2008) 034301-1-034301-9
- ↑ PacBio Ships First Two Commercial Systems; Order Backlog Grows to 44 | In Sequence | Sequencing | GenomeWeb
- ↑ PacBio Reveals Beta System Specs for RS; Says Commercial Release is on Track for First Half of 2011 | In Sequence | Sequencing | GenomeWeb
- ↑ After a Year of Testing, Two Early PacBio Customers Expect More Routine Use of RS Sequencer in 2012 | In Sequence | Sequencing | GenomeWeb
- ↑ PacBio's XL Chemistry Increases Read Lengths and Throughput; CSHL Tests the Tech on Rice Genome | In Sequence | Sequencing | GenomeWeb
- ↑ http://www.genomeweb.com/sequencing/pacbio-users-report-progress-long-reads-plant-genome-assembly-tricky-regions-hum
- ↑ «Copia archivada». Archivat des d'el original, el 26 de març de 2014. Consultat el 15 de giner de 2014.
- ↑ http://flxlexblog.wordpress.com/2013/06/19/longing-for-the-longest-reads-pacbio-and-bluepippin/
- ↑ «Pacific Biosciences: Consumables». Archivat des d'el original, el 21 d'abril de 2013. Consultat el 15 de giner de 2014.
- ↑ «PacBio Launches PacBio RS II Sequencer». Archivat des d'el original, el 19 de decembre de 2019. Consultat el 15 de giner de 2014.
- ↑ New Products: PacBio's RS II; Cufflinks | In Sequence | Sequencing | GenomeWeb
- Este artícul conté una traducció derivada de «Secuenciación SMRT» de Wikipedia en castellà publicada baix la Llicència de documentació lliure de GNU i la Llicència Creative Commons Reconeiximent-CompartirIgual 4.0 Internacional.