Inmunoelectroforesis

Erro al crear miniatura:

Inmunoelectroforesis creuada de dos microlitros de sèrum humà normal contra anticossos contra proteïnes séricas humanes. Anàlisis fet en 1975.

La inmunoelectroforesis és el nom genèric que reben un ampli número de métodos bioquímics per a la separació i caracterisació de proteïnes basades en l'electroforesis i la reacció en anticossos. Totes les variants de la inmunoelectroforesis requerixen immunoglobulines, anticossos que van a reaccionar en les proteïnes que es desija separar o caracterisar. Els métodos varen ser desenrollats i usats àmpliament durant la segona mitat de el XX.

Procediment

Se sol utilisar un gel d'agarosa al 1% en una gruixa propenca al milímetro, i un pH entorn al 8,6. Açò servix tant per a la electroforesis com per a la reacció en els anticossos. Es preferix la agarosa com a matriu de soport perque té un tamany de poro major que atres mijos, que permeten el lliure pas i separació de les proteïnes, pero en canvi és lo suficientment estret com per a impedir el pas dels complexos antígeno-anticòs. L'elevat pH s'utilisa perque, en eixes condicions, els anticossos són pràcticament immòvils. Se sol amprar una banyera de electroforesis de tipo horisontal.

Els complexos de inmunoprecipitación es poden vore en el mateix gel de agarosa, pero requerixen ser teñir en colorants per a proteïnes tals com el Blau Coomassie. En contrast en l'electroforesis en gel SDS, la electroforesis en gel de agarosa permet que les proteïnes estiguen en forma nativa (estructura cuaternaria), per lo que la inmunoelectroforesis permet la caracterisació de l'activitat enzimàtica i l'unió a ligandos ademés de la separació electroforética.

Tipos

En orde d'aparició, els métodos inmunoelectroforéticos varen ser:

• Anàlisis inmunoelectroforético (Inmunoelectroforesis d'una dimensió)
• Inmunoelectroforesis creuada (Inmunoelectroforesis quantitativa en dos dimensions)
• Inmunoelectroforesis en eixida (Inmunoelectroforesis quantitativa d'una dimensió)
• Contrainmunoelectroforesis
• Inmunoelectroforesis d'afinitat

El Anàlisis inmunoelectroforético és el més clàssic dels ensajos. Es fonamenta en la separació de les proteïnes per electroforesis, despuix de la que s'aplica, sobre el gel de agarosa, el sèrum d'anticossos sobre les proteïnes ya separades, despuix de lo que es forma un precipitat despuix d'un periodo adequat de difusió, per a permetre que les proteïnes es troben en els seus anticossos específics. L'introducció d'este ensaig va comportar un gran alvanç de la química de les proteïnes, i molts dels descobriments de proteïnes en líquits i extractes biològics es varen realisar per este método: va permetre caracterisar un gran número de proteïnes en sèrum i ademés es va poder establir l'existència de distintes classes d'immunoglobulines i els seus diferents característiques electroforéticas.

L'inmunoelectroforesis creuada, també cridada Inmunoelectroforesis quantitativa de dos dimensions, diferix del método anterior en el fet de que les proteïnes, despuix de la seua electroforesis inicial, no es incuba en anticossos. En el seu lloc, es tornen a sometre a una segona electroforesis, esta volta en un gel que ademés de buffer i agarosa, conté els propis anticossos contra la proteïna d'interés., de manera que és durant esta segona operació quan es formen els inmunoprecipitados, de tal manead que cada precipitat tindrà les seues pròpies característiques migratòries, en la qual cosa, cada banda que vejam correspondrà a un antígeno diferent, i ademés podrem, segons la posició del precipitat, conéixer la cantitat de proteïna aixina com la cantitat d'anticòs específic en el gel, de manera que es pot realisar una relativa quantificació dels components. La sensibilitat d'este ensaig és similar a l'anàlisis inmunoelectroforético convencional, pero hi ha múltiples variacions de la tècnica que la fan més útil segons el propòsit concret. Este tipo de inmunoelectroforesis ha segut especialment usat en estudis de proteïnes séries i extractes biològics.

L'inmunoelectroforesis en eixida es denomina aixina per la forma característica del precipitat que es forma en el gel. El principi consistix en carregar en el gel, de forma consecutiva i en perpendicular a la direcció del camp elèctric, dilució seriades en progressiu aument de la cantitat de antígeno, mentres que l'anticòs es troba repartit pel gel. Açò donarà lloc a un precipitat cada volta major (a mida que hi ha més antígeno) que dona un aspecte cònic que recorda a una eixida). Estos métodos s'utilisen per a la quantificació de proteïnes séries ans que aparegueren els métodos automatizado.

La contrainmunoelectroforesis consistix en l'aprofitament de la distinta movilitat electroforética dels dos components implicats. Ya que les immunoglobulines migran cap al pol negatiu i les proteïnes, donada la seua càrrega neta negativa, ho fan cap al positiu, es coloquen de forma inversa a la seua migració, forçant aixina la seua trobada. És dir, prop del pol positiu colocarem el sèrum en els anticossos que aniran contra el nostre antígeno, migrando estos cap al pol negatiu, mentres que prop del pol negatiu es carregaran els antígenos d'interés, a sabiendas de que migrarán cap al pol positiu. D'esta manera, abdós es trobaran (segons la seua movilitat electroforética) a una distància intermija, assegurant aixina l'interacció.

Per últim, la Inmunoelectroforesis d'afinitat està basada en els canvis del patró electroforético de les proteïnes per la seua interacció específica en les seues ligandos. Esta tècnica s'utilisa per a estimar constants de uníón. Algunes variants d'esta inmunoelectroforesis són similars a la cromatografía d'afinitat donat l'us de ligandos immovilisats.

L'estructura laxa del gel permet l'unió adicional d'anticossos marcats radiactivamente per a revelar proteïnes específiques. Esta variació s'ha usat en l'identificació d'alèrgics a través de la seua reacció en IgE.

Existixen dos factors que determinen perque els métodos inmunoelectroforesis no són els més utilisats. Per un costat, requerixen un treball intensiu i certa experiència manual. Ademés, requerixen llarcs estocs d'anticossos policlonales. Hui en dia, la electroforesis en gel és el método d'elecció per a la caracterisació de proteïnes, ya que és fàcil de realisar, altament sensible i requerix un baix número d'anticossos específics. Ademés, les proteïnes són separades sobre la base del seu pes molecular, lo que no succeïx en la inmunoelectroforesis, encara que este método seguix sent pràctic quan no es requerixen condicions reductores.