High Resolution Melt
High Resolution Melt (HRM) o anàlisis d'alta resolució de fusió, és una tècnica de biologia molecular basada en l'estudi i comparació de curves de fusió de les cadenes de ADN. Les seues principals aplicacions són la detecció de mutacions, polimorfisme i alteracions epigenéticas en mostres d'ADN bicatenario.
Tecnologia Aplicada
[editar | editar còdic]L'anàlisis de High Resolution Melt comença en una PCR en temps real en la qual s'amplifica la seqüència de ADN d'interés. Durant este procés s'afigen colorants fluorescents en la finalitat de que es intercalen en el ADN, com per eixemple SYBR Green, SYTO Dye o Chromofy.
El amplicón resultant de la PCR en temps real es calfa gradualment en el termociclador des de 55 °C fins a 95 °C. Conforme la temperatura va aumentant, el ADN bicatenario es va desnaturalizando, de manera que la doble cadena se separa i la fluorescència va disminuint. A continuació, es realisa una gràfica de nivell de fluorescència i temperatura, obtenint una curva de melting, en la qual es pot detectar el canvi d'una sola base, ya que les diferents seqüències genètiques van a presentar chicotetes variacions de temperatura de desnaturalización.[1]
D'esta forma, es pot estudiar la presència de SNPs, la homocigosis o heterocigosis d'una mostra, aixina com les seues marques epigenéticas. Sobre este últim cas, si a la mostra inicial de ADN se li afig bisulfito, les citosina no metiladas les transforma en uracilos, canviant d'esta forma la temperatura de desnaturalización i generant curves de melting diferents, pels que a través de l'estudi per comparació, es pot detectar les bases de citosina metiladas.[2]
Intercalado de fluoróforos
[editar | editar còdic]Per a seguir la transició de ADN de doble cadena a cadena simple (melting), s'ampren colorants o fluróforos que es intercalan en doble hèliç de el ADN. Estos fluoróforos deuen complir una condició: la seua emissió de fluorescència deu dependre de l'estat en el que es troba el ADN al que s'associa, de modo que emeta fluorescència quan està unit a el ADN de doble cadena, pero no quan es disocia en ADN de cadena simple (o viceversa).
El fluoróforo SYBR Green va ser el primer en ser usat en la tècnica, no obstant, actualment es recomana l'us de intercalantes que s'unixquen uniformemente al amplicón com el EvaGreen.
Aplicacions
[editar | editar còdic]Prova de cigosidad
[editar | editar còdic]En l'actualitat, hi ha molts métodos per a detectar l'estat de cigosidad d'un gen en un locus determinat, és dir, detectar si, per a un gen concret, un individu és homocigótico o heterocigótico. No obstant, l'us de HRM reduïx el temps necessari per a l'anàlisis i el risc de contaminació. Ademés, esta tècnica no solament permet identificar si l'individu és homocigótico o heterocigótico respecte a eixe gen concret, sino que també dona informació sobre que tipo de homo o heterocigosis té per mig de les distintes curves que s'obtenen per les diferències de temperatura de melting.
Epigenética
[editar | editar còdic]La tècnica HRM també s'usa per a estudiar l'estat de metilación de el ADN. El ADN metilado pot ser tractat en bisulfito, que convertix les citosina no metiladas en uracilos. Per lo tant, els productes resultants de la PCR que no estaven metilados originalment tindran una curva de melting menor que aquells derivats d'una cadena metilada. També és possible determinar la proporció de metilación en una mostra comparant-la en una curva estàndar, generada mesclant diferents proporcions de ADN metilado i no metilado.
Referències
[editar | editar còdic]- Este artícul conté una traducció derivada de «High Resolution Melt» de Wikipedia en castellà publicada baix la Llicència de documentació lliure de GNU i la Llicència Creative Commons Reconeiximent-CompartirIgual 4.0 Internacional.