Ensaig de toxicitat per via cutànea

Els ensajos de toxicitat per via cutànea tenen l'objectiu d'evaluar els efectes adversos que manifesta una substància determinada en ser aplicada de manera tòpica. Estos són requerits per les agències reguladores.

En concret, la toxicitat aguda és la capacitat que tenen diverses substàncies de produir reaccions adverses despuix d'una sola exposició. Els ensajos sobre este tipo de toxicitat donen informació sobre la seua perillositat.

Estudis de Toxicitat Aguda per via cutànea (OCDE 402)

Objectiu

Proporcionar informació sobre els riscs i conseqüències que poden sorgir despuix d'una exposició aguda per via cutànea a una substància determinada.

Condicions generals

• Espècies animals: es recomana l'us de rates adultes, preferiblement femelles. Deuen tindre entre 8-10 semanes d'edat, estar sanes i pesar 200-300 g.

• Preparació de l'animal: aclimatar als animals 5 dies abans en gàbies grupales. Marcar als animals per a que tinguen una identificació individualisada. Es deu retirar el pèl de la zona dorsal un dia abans de començar l'ensaig (a lo manco un 10 % de la superfície corporal). Intentar no danyar la pell durant el maneig de l'animal per a no alterar la permeabilidad de la pell.

• Condicions de l'ensaig: la temperatura de la sala deu ser de 22 °C ± 3 °C i la humitat relativa deu ser d'a lo manco 30 % sense excedir el 70 %. Quan es tracte d'un allumenament artificial deu haver una seqüència de 12 hores de llum i 12 hores d'obscuritat.

Procediment

• Administració: Aplicar uniformemente la substància a estudiar en la pell afaitada. Es deu cobrir en una gasa porosa i en una cinta que no irrite la pell durant 24 hores. En estes 24 hores els animals deuen estar en gàbies individuals per a evitar l'ingestió oral de la substància d'estudi per atres rates. Si la substància d'estudi és sòlida, estos deuen estar humida, preferiblement en aigua o en un vehícul que facilite la penetració en la pell. En el cas d'utilisar este últim, es deu tindre en conte la seua influència a l'hora de facilitar l'absorció de la substància. S'utilisen entre 0,5 o 1 ml de vehícul. Quan s'estudien substàncies líquides, estes solen estar sense diluir. Despuix de les 24 hores, es deuen retirar els residus de la substància que queden en la pell ya siga en aigua o en un solvent apropiat. Es du de nou a la rata a les gàbies grupales i es passa al periodo d'observació.

Figura 1. Esquema explicatiu del procediment a seguir en l'Estudi de busca del ranc de dosis.

Figura 2. Esquema explicatiu del procediment a seguir en l'Estudi principal.

• Dosis i números d'animals: primer es fa un estudi de busca del ranc de dosis en les que es deu treballar i començar en l'estudi principal. Es va a usar una sola rata per cada grup de dosis. S'administra una dosis inicial de 200 mg/kg i segons l'efecte que tinga, se li administrarà una dosis menor de 50 mg/kg a una atra rata (si es produïx la mort de la rata anterior), o una dosis major de 100 mg/kg a una atra rata (si la rata anterior no ha mort o solament ha presentat toxicitat). Es fa exactament lo mateix en el restant de grups de dosis com es pot observar en la Figura 1. Despuix d'haver fet l'estudi de ranc de dosis, es fa l'estudi principal. En este es van a usar 2 rates per grup de dosis i nos va a permetre classificar a la substància que estudiem en una categoria determinada de el GHS (Sistema Mundialment Harmonisat de Classificació i Etiquetage de Productes Químics). Sobre la toxicitat aguda existixen 5 categories, que va des de la 1, substància molt tòxica i que produïx mortalitat en contacte en la pell; a la 5 , substància que pot ser nociva en contacte en la pell. Depenent dels resultats que hajam obtingut en l'estudi anterior es deu començar en una dosis o en una atra, lo més comuna és que siga de 200 mg/kg. Se li dona dita dosis a dos rates i depenent dels efectes que tinga es pot classificar directament en una de les categories (si es produïx una mort), es donen a atres dos rates una dosis menor a l'inicial (si es produïxen dos morts) o s'administra una dosis major a atres dos rates (si no s'han vist evidències de toxicitat o no s'ha produït cap mort). I aixina es fa en el restant de dosis com apareix en la Figura 2.

Observació

Observar a la rata despuix d'administrar-li la dosis. posteriorment vigilar periòdicament en les 24 hores posteriors prestant maig atenció en les primeres 2 i 6 hores. Seguir observant durant 14 dies. Observar els canvis que es produïxquen en la pell i el pelaje, ulls i mucoses oculars. També deuen tindre's en conte canvis en el sistema respiratori, circulatori, nerviós central i autònom, en l'activitat somàtica i patrons de comportament. Si hi ha rates sofrint dolor o estrés sever o inclús es troben en estat moribunt, es deuen sacrificar. Es deu pesar a les rates abans i despuix de l'exposició a la substància (a lo manco una volta per semana). En finalisar l'estudi, es deu passar a les rates de nou i sacrificar-les. Tant a les que s'han sacrificat al final de l'estudi com a les que s'hagen tingut que sacrificar durant el mateix, se'ls realisa una autòpsia i s'observen els danys que s'hagen produït en els òrguens.

Estudis d'irritament/corrosió aguda en la pell (OCDE 404)

Objectiu

Proporcionar informació sobre l'irritament o corrosió que pot sorgir despuix de l'exposició aguda per via cutànea d'una substància determinada.

Condicions generals

• Espècies animals i la seua preparació per a l'estudi: es preferix usar conills albinos adults sans. Retirar el pèl de la zona dorsal de l'animal 24 hores abans de l'estudi. Cal evitar danyar la pell durant este procés per a que no varie la permeabilidad.

• Condicions de l'ensaig: estajar als animals individualment a una temperatura de 20 °C ± 3 °C i una humitat relativa d'a lo manco 30 % sense que supere el 70 %. Quan es tracte d'un allumenament artificial deu haver una seqüència de 12 hores de llum i 12 hores d'obscuritat.

Procediment

• Administració: s'aplica la substància en la zona afaitada cobrint-se en una gasa i subjectant-la en una cinta que no irrite la pell. Quan no es puga realisar una aplicació directa, colocar la substància directament en una gasa i esta es coloca sobre la pell. Deu quedar llaugerament folgada i s'acompanya d'un vendaje semioclusivo durant el periodo d'exposició. Cal previndre que l'animal siga capaç d'accedir a la gasa i es produïxca l'inhalació o ingestió del químic a estudiar. Quan la substància és líquida, esta sol estar sense diluir. Si, pel contrari, la substància és sòlida, deu estar lo suficientment humida, preferiblement en aigua o sino en un vehícul, per a assegurar el contacte directe en la pell. En cas d'utilisar un vehícul, este no deu provocar irritament en la pell. En terminar el temps d'exposició (que sol ser de 4 hores), es retiren els residus de la substància que queden en la pell ya siga en aigua o en un solvent apropiat.

• Nivell de dosis: 0.5 ml de líquit o 0.5 g de sòlit o pasta.

• Test inicial (Estudi in viu d'irritament/corrosió dérmica usant un animal): Els experiments in viu sobre corrosió o irritament d'una substància no seran necessaris en el cas de que s'haja pogut demostrar en proves fefaents en estudis in vitro. En el cas de necessitar estudis in viu es va a realisar un test inicial sobre un sol animal d'experimentació. La substància d'estudi es va a aplicar 3 voltes consecutives. La primera volta que es done es va a retirar als 3 minuts, si no s'observen signes preocupants sobre la pell, s'aplica de nou per a retirar-la una hora més tart. De nou, si no s'observen signes d'alerta es torna a aplicar i es retira a les 4 hores. Despuix d'esta última aplicació, s'evalua la gravetat de la lesió. Si no s'observa corrosió despuix de la retirada de les tres gases s'observa a l'animal durant 14 dies a no ser que aparega de forma tardana. En canvi, si s'observa corrosió en alguna de les tres aplicacions que es realisen es deu terminar immediatament l'estudi.

• Test de confirmació (Estudi in viu d'irritament dérmica en animals adicionals): si en la prova inicial no es va observar efecte irritante sever o corroent de la substància d'ensaig, açò ha de confirmar-se utilisant 2 animals més, cada u en un pegat durant un periodo d'exposició de 4 hores. Si s'observa un efecte irritante en la prova inicial, es recomana que la prova de confirmació es realise de manera seqüencial o exponent a 2 animals adicionals simultàneament. En el cas excepcional en el que la prova inicial no es faça, 2 o 3 animals han de ser tractats en un pegat que es llevarà despuix de 4 hores. Quan s'usen 2 animals, si abdós presenten la mateixa resposta, no és necessari portar a terme més proves. De lo contrari, s'usa un tercer animal.

Observació

• Periodo d'observació: Ha de ser suficient per a evaluar tant les reaccions cutànees com la reversibilidad de les mateixes. En el cas en el que s'observe que l'animal sofrix dolor o estrés intens, l'estudi deu finalisar-se. Per a poder observar la reversibilidad dels síntomes s'observa a l'animal durant 14 dies despuix de retirar la gasa i el producte.  Si s'observa reversibilidad ans que passe eixe periodo de temps, l'ensaig termina.

• Observacions clíniques i classificació de les reaccions cutànees: es deu examinar a tots els animals en busca de signes de eritema i edema, ademés cal prendre nota de les respostes que tinga als 60 minuts, 24, 48 i 72 hores despuix de retirar la gasa. Per al test inicial, immediatament despuix de la retirada de la gasa s'ha d'examinar la zona en la que s'ha expost la substància. Les reaccions cutànees es graduen segons la següent classificació:

Graduació de lesions eritematosas

Grau 0	No eritema
Grau 1	Eritema llauger casi imperceptible
Grau 2	Eritema ben definit
Grau 3	Eritema moderat, casi sever
Grau 4	Eritema sever

Graduació de les lesions edematosas

Grau 0	No edema
Grau 1	Edema llauger casi imperceptible
Grau 2	Edema llauger
Grau 3	Edema moderat (elevació d'1 mm)
Grau 4	Edema sever (elevació de més d'1 mm i aplega més allà de la zona exposta a la substància)

La classificació de les lesions deu ser portada a terme per personal especialisat.